Efficacité des feuilles de Stevia Rebaudiana contre les différentes bactéries à gram négatifs in vitro

Efficacité de l’extrait de feuilles entières de Stevia Rebaudiana contre les différentes bactéries à gram négatifs in vitro

 

La maladie de Lyme est une maladie multisystémique à tiques causée par Borrelia burgdorferi. Administrer des antibiotiques est le principal traitement de cette maladie; Cependant, la rechute survient souvent lorsque le traitement antibiotique est interrompu. La raison de la rechute reste inconnue, mais des études récentes ont suggéré les possibilités de présence de cellules et de biofilms résistant aux antibiotiques. La Serrapeptase peut aider pour lutter contre les biofilms mais il semblerait que cela ne soit pas suffisant. La Stevia aiderait également à lutter contre les biofilms.

 

Etude :

Dans cette étude, nous avons évalué l’efficacité de l’extrait de stévia à feuilles entières contre les formes de spirochetes, et le biofilm de B. burgdorferi in vitro. La susceptibilité des différentes formes a été évaluée par diverses techniques quantitatives en plus des différentes méthodes de microscopie. L’efficacité de la stévia a été comparée à la doxycycline, la cefoperazone, la daptomycine et leurs combinaisons. Nos résultats ont démontré que la stévia avait un effet significatif dans l’élimination des spirochetes et persisters de B. burgdorferi. Les expériences de sous-culture avec la Stevia et les cellules traitées aux antibiotiques ont été établies pendant 7 et 14 jours, donnant, non et 10% de cellules viables, respectivement par rapport aux antibiotiques et à la combinaison d’antibiotiques mentionnés ci-dessus. Lorsque la stévia et les trois antibiotiques ont été testés contre des biopuces attachées, la stévia a considérablement réduit les formes de B. burgdorferi. Les résultats de cette étude suggèrent qu’un produit naturel tel que l’extrait de feuilles de Stevia pourrait être considéré comme un agent efficace contre B. burgdorferi.

La maladie de Lyme est une maladie multisystémique à base de tiques menée par la spirochette Borrelia burgdorferi. La bactérie est transmise par les tiques d’Ixodes, qui pourraient se nourrir de souris à foetus blancs, de rongeurs, de cerfs et d’oiseaux . Aux États-Unis, environ 300 000 personnes reçoivent un diagnostic de maladie de Lyme chaque année. Le traitement de première ligne de la maladie de Lyme est l’utilisation d’antibiotiques tels que la doxycycline chez l’adulte et l’amoxicilline chez les enfants . Ces antibiotiques sont jugés efficaces dans la plupart des cas de patients diagnostiqués avec une maladie de Lyme . Cependant, selon les Centers for Disease Control (CDC), environ 10 à 20% des patients atteints de la maladie de Lyme traités avec des antibiotiques pendant 2 à 4 semaines recommandés ont subi des symptômes de fatigue, de douleurs ou de douleurs articulaires et musculaires . Chez certains patients, les symptômes ont même duré plus de 6 mois . Cette condition a été appelée «syndrome post-traitement de la maladie de Lyme (PTLDS)» ou «maladie chronique de Lyme» .

Le mécanisme associé à cette affection chez les patients reste incertain. Bien que n’étant pas prouvé, il existe quelques explications suggérées, telles que l’incapacité du système immunitaire à éliminer complètement B. burgdorferi, ou en raison de la présence de débris antigéniques, ce qui pourrait provoquer des réponses immunologiques. Une autre possibilité de Borrelia qui échappe à la clairance immunitaire de l’hôte après un traitement antibiotique n’est pas bien comprise;

Des études antérieures in vivo sur des souris, des chiens et des primates non humains ont montré que B. burgdorferi ne pouvait pas être complètement éliminé par divers antibiotiques tels que la doxycycline, la ceftriaxone et la tigécycline. De plus, une étude récente a démontré la présence d’ADN de Borrelia chez la souris après 12 mois de traitement antibiotique [14]. Cependant, la culture d’organismes viables dans les milieux de croissance Borrelia n’a pas pu être réalisée dans ces études [14-17]. Une étude récente a révélé la présence d’ADN de Borrelia chez un patient atteint de PTLDS après un traitement antibiotique [18]. Des études cliniques prospectives ont démontré qu’il n’existait pas de thérapie antibiotique efficace significative et n’a pas démontré la présence continue de B. burgdorferi chez des patients présentant des symptômes à long terme [19, 20]. D’autres essais utilisant un traitement de ceftriaxone par voie intraveineuse prolongée ont seulement amélioré les symptômes de fatigue [21]. En résumé, les résultats suggèrent que les traitements conventionnels peuvent ne pas éliminer complètement les patients persistants de Borrelia.

Le style de vie de B. burgdorferi est complexe puisqu’il existe dans différentes formes morphologiques comme les spirochètes, les sphéroplastes (ou la forme L), les corps ronds et les biofilms . Plusieurs études montrent que Borrelia peut se transformer en corps ronds lorsque les conditions deviennent défavorables telles que les changements de température, le pH élevé ou faible, la famine, l’exposition aux antibiotiques et / ou même une attaque du système immunitaire. Borrelia dans ces formes défensives devient dormant, immobile et reste dans cet état morphologique jusqu’à ce qu’il trouve des conditions favorables pour revenir à sa forme spirochète . La cachette la plus efficace proposée pour B. burgdorferi est la forme de biofilm récemment suggérée. Les biofilms bactériens sont des communautés organisées de cellules enfermées dans une matrice polymère hydratée auto-produite ou des substances polymères extracellulaires (EPS), qui est un mélange complexe de polysaccharides, de protéines lipidiques, d’acides nucléiques et d’autres macromolécules . Cette matrice unique protège les cellules sous-jacentes des agents antimicrobiens. L’élimination des bactéries pathogènes dans leur forme de biofilm est très difficile car ces cellules bactériennes  peuvent supporter les réponses immunitaires de l’hôte et sont beaucoup moins susceptibles aux antibiotiques ou à tout autre biocide que leurs homologues planctoniques individuels. La résistance au biofilm est basée sur de multiples mécanismes tels que les changements phénotypiques des cellules qui se forment dans le biofilm, l’expression des pompes d’efflux et la présence de cellules persistantes qui résistent à la destruction lorsqu’elles sont exposées à des agents antimicrobiens.

Récemment, nous avons démontré que B. burgdorferi est capable de former des biofilms in vitro. L’agrégation des formes de spirochete et de corps rond avec plusieurs couches de protection différentes qui composent le biofilm et les substances polymères extracellulaires (EPS) est proposé comme un facteur important de résistance aux antibiotiques. Il est également rapporté que les biofilms ont une population plus élevée des cellules, ce qui pourrait conduire à la résistance antimicrobienne représentée par ces formes .

Nos résultats précédemment publiés sur les effets in vitro de la doxycycline sur B. burgdorferi ont montré que différentes formes morphologiques ont des sensibilités uniques aux agents antimicrobiens. Une étude récente de J. Feng et al. Ont montré que la doxycycline était efficace pour réduire les spirochètes mais pas les persisters de B. burgdorferi. Des études ont également montré que la doxycycline et l’amoxicilline pourraient éliminer la forme spirochale de B. burgdorferi, mais les pacines dormantes / les agrégats / microcolones de type biofilm n’étaient pas sensibles à ces antibiotiques. Par conséquent, il est urgent de trouver des agents efficaces, qui peuvent cibler / éliminer toutes les formes morphologiques de Borrelia.

Les agents antimicrobiens naturels, qui ont été utilisés pendant des milliers d’années, se sont révélés efficaces contre divers agents pathogènes. Beaucoup d’études in vitro et cliniques ont démontré leur efficacité non seulement contre B. burgdorferi mais aussi contre de nombreux autres agents pathogènes. Stevia rebaudiana qui appartient à la famille des Asteraceae est généralement appelée feuille de miel ou feuille douce, et en raison de sa douceur naturelle, elle est utilisée comme substitut naturel à l’édulcorant synthétique. L’extrait de feuille de Stevia possède de nombreux phytochimiques, dont l’austroinulline, le β-carotène, le dulcoside, la nilacine, les oxydes de rebaudi, la riboflavine, le steviol, le stevioside et la tiamine avec des propriétés antimicrobiennes connues contre de nombreux agents pathogènes. Le rôle de ces composés est principalement de protéger la plante contre une infection microbienne et des conditions environnementales défavorables. La stévia est également bien connue dans la médecine traditionnelle pour son utilisation dans le traitement de nombreuses maladies comme le diabète, l’hypertension artérielle et la perte de poids. Dans quelques études cliniques, il est rapporté que le stevioside phytochimique réduit la tension artérielle chez les patients souffrant d’hypertension artérielle légère et réduit les taux de glucose dans le sang chez les patients diabétiques de type 2. Il a également été démontré que les patients n’avaient pas eu d’effets néfastes sur l’utilisation du stéviose.

Compte tenu de l’efficacité de l’extrait de feuille de Stevia en laboratoire et en études cliniques, nous avons évalué le potentiel antimicrobien de la Stevia (extraits de feuilles entières) contre le pathogène pathogène de la maladie de Lyme, B. burgdorferi, dans le but d’éliminer toutes les différentes formes morphologiques in vitro. Pour évaluer efficacement l’extrait de feuille de Stevia entier, nous avons comparé l’effet antimicrobien de Stevia avec les antibiotiques (doxycycline, cefoperazone, daptomycine) et leur combinaison, qui ont récemment été jugés efficaces contre les résistances Borrelia.

Matériaux et méthodes
Conditions de culture bactérienne et exigences des médias

Des isolats à faible passage (≤ 8) de la souche B31 de B. burgdorferi ont été obtenus de la American Type Culture Collection (ATCC 35210) et ont été cultivés dans des milieux Barbour-Stoner-Kelly H (BSK-H) (Sigma, St Louis, MO) complétés Avec 6% de sérum de lapin (Pel-Freez®, Rogers, AR). Les cultures exemptes d’antibiotiques ont été maintenues dans des tubes de verre stérile de 15 ml et incubées à 33 ° C avec 5% de CO2. Pour la phase logarithmique (log), 1 x 105 cellules / ml ont été ensemencées dans des tubes de verre et laissées croître pendant 5 jours. L’efficacité des agents antimicrobiens sur la phase logarithmique a été testée en inoculant 1 x 105 spirochètes / ml de la culture cultivée de cinq jours (contenant seulement des spirochètes) dans 90 μl de milieu BSK-H dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits (BD Falcon , Franklin Lakes, NJ), qui ont été incubés pendant 5 jours à 33 ° C avec 5% de CO2. Les cellules ont été traitées avec des agents antimicrobiens pendant 3 jours après une période d’incubation de deux jours. De même, pour la phase stationnaire, 1 x 105 cellules / ml ont été ensemencées dans des tubes de verre et laissées pousser pendant 7 jours. L’efficacité des agents antimicrobiens a été testée en inoculant 1 x 106 spirochètes / ml dans 90 μl de milieu BSK-H dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits, qui a été incubée pendant 8 jours à 33 ° C avec 5% de CO2. Les cellules persistantes en phase stationnaire ont été traitées avec des agents antimicrobiens pendant 3 jours après 5 jours d’incubation. Des biofilms ont été générés en inoculant 5 x 106 cellules / ml de spirochetes Borrelia dans 1 ml de milieu BSK-H dans des lames de chambre à quatre chambres (Thermo Scientific, Waltham, MA) ou des plaques de 48 couches à base de plastique / revêtement collagène (BD Falcon) , Qui ont été incubés pendant 7 jours à 33 ° C avec 5% de CO2. Le régime de traitement des biofilms était le même que pour la phase stationnaire.

Composés et préparation d’antibiotiques

Différents extraits de stévia fabriqués par Nutramedix®, Now®, Sweet Leaf® et Truvia® ont été achetés dans des magasins d’aliments naturels aux États-Unis et ont été étiquetés de façon aléatoire comme Stevia A, B, C et D. Les extraits A, B et C Ont été formulés par un procédé d’extraction d’alcool standard alors que l’extrait D a été acheté sous forme de poudre dissous dans de l’eau distillée. On a préparé du Stevioside (Sigma) dans 0,001% de DMSO et on l’a encore dilué dans 1 x de solution salée tamponnée au phosphate (PBS, 0,1 M, pH 7,4 à partir de Sigma). Les antibiotiques doxycycline, la cefoperazone et la daptomycine (Sigma) à une concentration de 10 ug / ml ont été préparés dans du PBS. Tous les agents antimicrobiens ont été stérilisés en utilisant une unité de filtration de 0,2 μm (EMD Millipore, Billerica, MA). Les solutions antibiotiques ont été réparties en aliquotes et stockées à moins 20 ° C.

Déterminer les concentrations en protéines des agents antimicrobiens

Comme la concentration des composants antimicrobiens dans les extraits de Stevia A, B, C et D était inconnue, les unités de concentration utilisées impliquaient initialement l’utilisation d’une partie de soluté pour 50 parties de solution (dilution 1:50). La teneur en protéines des agents antimicrobiens a été déterminée par le dosage de Bradford (Sigma) en utilisant des dilutions en série de 2 mg / ml de stock de sérum bovin (Sigma) dans du PBS à pH 7,4 en tant que norme. Le réactif de Bradford a été ajouté aux agents antimicrobiens selon les instructions du fabricant et a été incubé pendant 10 min à température ambiante avec un tremblement doux. L’absorbance a été mesurée à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre BioTek.
Test de sensibilité antimicrobienne in vitro de B. burgdorferi

Les antibiotiques efficaces et la combinaison d’antibiotiques identifiés [30] ont été testés pour comparer et évaluer l’efficacité de la stévia sur B. burgdorferi. En tant que témoin positif, on a utilisé de la doxycycline (10 μg / ml). En tant que témoin négatif, 1 x PBS à pH 7,4 a été utilisé pour dissoudre les antibiotiques et 25% d’alcool (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), car tout l’extrait de Stevia contenait le même diluant d’alcool.

SYBR Green I / PI test

Pour évaluer les cellules vivantes et mortes, le test d’iodure SYBR Green I / propidium standard (SYBR Green I / PI) a été réalisé comme décrit précédemment [30, 31, 46, 47]. Pour 1 ml d’eau distillée stérilisée, 10 μl de SYBR Green I (10,000 × stock, Invitrogen, Grand Island, NY) et 30 μl d’iodure de propidium (Thermo Scientific) ont été brièvement mélangés. Le mélange de coloration (10 μl) a été ajouté à tous les puits contenant B. burgdorferi et a été incubé dans l’obscurité pendant 15 min. Les plaques ont été mesurées en utilisant un lecteur fluorescent (BioTek FLx800) en réglant la longueur d’onde d’excitation à 485 nm et la longueur d’onde d’absorbance à 535 nm (émission verte) et 635 nm (émission rouge). L’équation standard a été déterminée à partir de 1 × 106 cellules (phase logarithmique), 5 × 106 cellules (phase stationnaire) et 1 × 107 cellules (7 jours et 14 jours de sous-culture). Une population vivante et morte a été préparée. Pour la population de cellules mortes, les cellules ont été tuées en ajoutant 300 μl d’alcool isopropylique à 70% (Fisher Scientific). Des suspensions de B. burgdorferi à différents rapports de cellules vivantes / mortes (0:10, 2: 8, 5: 5, 8: 2, 10: 0) ont été ajoutées aux puits de la plaque à 96 puits en conséquence. Le mélange de coloration a été ajouté à chacun des cinq échantillons, et la plaque a été lue comme ci-dessus. En utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon de la plaque de criblage. En outre, les images de l’échantillon traité ont été prises en utilisant une microscopie fluorescente (Leica DM2500).
Total des comptes viables de B. burgdorferi

À titre de test de confirmation, les cultures SYBR Green / PI colorées ont été évaluées pour la croissance cellulaire en comptant directement des bactéries vivantes et mortes en utilisant une chambre de comptage bactérienne (Hausser Scientific, Horsham, PA) et une microscopie fluorescente (Leica DM2500). Comme ci-dessus, en utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon.

SYBR Green I / PI test

Pour évaluer les cellules vivantes et mortes, le test d’iodure SYBR Green I / propidium standard (SYBR Green I / PI) a été réalisé comme décrit précédemment [30, 31, 46, 47]. Pour 1 ml d’eau distillée stérilisée, 10 μl de SYBR Green I (10,000 × stock, Invitrogen, Grand Island, NY) et 30 μl d’iodure de propidium (Thermo Scientific) ont été brièvement mélangés. Le mélange de coloration (10 μl) a été ajouté à tous les puits contenant B. burgdorferi et a été incubé dans l’obscurité pendant 15 min. Les plaques ont été mesurées en utilisant un lecteur fluorescent (BioTek FLx800) en réglant la longueur d’onde d’excitation à 485 nm et la longueur d’onde d’absorbance à 535 nm (émission verte) et 635 nm (émission rouge). L’équation standard a été déterminée à partir de 1 × 106 cellules (phase logarithmique), 5 × 106 cellules (phase stationnaire) et 1 × 107 cellules (7 jours et 14 jours de sous-culture). Une population vivante et morte a été préparée. Pour la population de cellules mortes, les cellules ont été tuées en ajoutant 300 μl d’alcool isopropylique à 70% (Fisher Scientific). Des suspensions de B. burgdorferi à différents rapports de cellules vivantes / mortes (0:10, 2: 8, 5: 5, 8: 2, 10: 0) ont été ajoutées aux puits de la plaque à 96 puits en conséquence. Le mélange de coloration a été ajouté à chacun des cinq échantillons, et la plaque a été lue comme ci-dessus. En utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon de la plaque de criblage. En outre, les images de l’échantillon traité ont été prises en utilisant une microscopie fluorescente (Leica DM2500).
Total des comptes viables de B. burgdorferi

À titre de test de confirmation, les cultures SYBR Green / PI colorées ont été évaluées pour la croissance cellulaire en comptant directement des bactéries vivantes et mortes en utilisant une chambre de comptage bactérienne (Hausser Scientific, Horsham, PA) et une microscopie fluorescente (Leica DM2500). Comme ci-dessus, en utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon.

SYBR Green I / PI test

Pour évaluer les cellules vivantes et mortes, le test d’iodure SYBR Green I / propidium standard (SYBR Green I / PI) a été réalisé comme décrit précédemment [30, 31, 46, 47]. Pour 1 ml d’eau distillée stérilisée, 10 μl de SYBR Green I (10,000 × stock, Invitrogen, Grand Island, NY) et 30 μl d’iodure de propidium (Thermo Scientific) ont été brièvement mélangés. Le mélange de coloration (10 μl) a été ajouté à tous les puits contenant B. burgdorferi et a été incubé dans l’obscurité pendant 15 min. Les plaques ont été mesurées en utilisant un lecteur fluorescent (BioTek FLx800) en réglant la longueur d’onde d’excitation à 485 nm et la longueur d’onde d’absorbance à 535 nm (émission verte) et 635 nm (émission rouge). L’équation standard a été déterminée à partir de 1 × 106 cellules (phase logarithmique), 5 × 106 cellules (phase stationnaire) et 1 × 107 cellules (7 jours et 14 jours de sous-culture). Une population vivante et morte a été préparée. Pour la population de cellules mortes, les cellules ont été tuées en ajoutant 300 μl d’alcool isopropylique à 70% (Fisher Scientific). Des suspensions de B. burgdorferi à différents rapports de cellules vivantes / mortes (0:10, 2: 8, 5: 5, 8: 2, 10: 0) ont été ajoutées aux puits de la plaque à 96 puits en conséquence. Le mélange de coloration a été ajouté à chacun des cinq échantillons, et la plaque a été lue comme ci-dessus. En utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon de la plaque de criblage. En outre, les images de l’échantillon traité ont été prises en utilisant une microscopie fluorescente (Leica DM2500).
Total des comptes viables de B. burgdorferi

À titre de test de confirmation, les cultures SYBR Green / PI colorées ont été évaluées pour la croissance cellulaire en comptant directement des bactéries vivantes et mortes en utilisant une chambre de comptage bactérienne (Hausser Scientific, Horsham, PA) et une microscopie fluorescente (Leica DM2500). Comme ci-dessus, en utilisant l’analyse de moindres carrés, l’équation de régression a été calculée entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports de fluorescence verte / rouge. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque échantillon.

Résultats

Dans cette étude, nous avons comparé et évalué l’effet antimicrobien de l’extrait de feuilles entières de S. rebaudiana avec les antibiotiques doxycycline, cefoperazone et daptomycine sur les différentes formes morphologiques (spirochètes, corps ronds et biofilms) de B. burgdorferi. Nous avons utilisé une méthode de dépistage à haut débit récemment développée [30, 31, 46] pour évaluer la viabilité de la phase logarithmique et de la phase stationnaire B. burgdorferi après les différents traitements antimicrobiens (quantitativement et qualitativement) en conjonction avec les méthodes de comptage direct comme décrit dans notre Publication précédente [7]. À l’instar des études récentes, nous avons évalué à la fois la phase logarithmique B. cultures de burgdorferi qui consistent en spirochètes individuelles, les cultures en phase stationnaire qui se composent des cellules persistantes et la forme la plus résistante de B. burgdorferi, les biofilms en surface attachés. Enfin, la microscopie à force atomique a été utilisée conjointement avec les méthodes susmentionnées, pour visualiser les changements dans la morphologie dans les biopuces ci-joint avant et après les traitements antibiotiques.

Criblage préliminaire de différents extraits de Stevia

Ici, nous avons d’abord évalué quatre extraits de Stevia extraits commercialement (3 extraits d’alcool et un extrait sous forme de poudre) et le Stevioside purifié sur B. burgdorferi pour trouver l’agent le plus efficace pour d’autres études utilisant le test SYBR Green / PI. La concentration en protéines des quatre extraits de feuilles de Stevia a été déterminée par un dosage standard de Bradford et variait de 1,2 μg / ml à 1,9 μg / ml. Le stevioside a été testé à une concentration de 100 à 1000 μg / ml, concentration indiquée dans une étude antérieure [42].

Pour les expériences de présélection, nous avons préalablement testé tous les agents sur les cultures de Borrelia en bûche et en phase stationnaire à différentes concentrations en utilisant le test SYBR Green / PI. Nos résultats ont montré que les agents extractifs alcooliques Stevia A, Stevia B et Stevia C avaient des effets significatifs sur la viabilité des cellules Borrelia, mais la Stevia D, la forme en poudre et le Stevioside n’ont pas eu d’effet significatif sur la phase logarithmique et la phase stationnaire cellules. La figure 1 montre une expérience représentative démontrant que les agents de Stevia basés à base d’alcool (A, B, C) étaient les plus efficaces contre les résistances de Borrelia, tandis que la forme en poudre de l’extrait de feuille de Stevia (D) et du Stevioside n’avait aucun effet sur ces cellules résistantes . En outre, la Stevia A a montré l’effet le plus prometteur dans toutes les expériences et, par conséquent, la Stevia A a été utilisée dans les expériences ultérieures sur les différentes formes morphologiques de B. burgdorferi.

La stévia est un agent potentiel pour éliminer différentes formes de B. burgdorferi

Pour comparer et évaluer l’efficacité de la Stevia sur B. burgdorferi, des antibiotiques potentiels récemment identifiés et leurs combinaisons ont été testés avec l’extrait de Stevia A en utilisant le test SYBR Green I / PI sur les cultures en bûche et en phase stationnaire. Des quantités appropriées de 1 × PBS pH 7,4 et 25% d’alcool ont été utilisées comme témoins négatifs.

Selon le test SYBR Green I / PI et les images en direct / mort, le traitement avec 1 × PBS ou 25% d’alcool n’a pas réduit de manière significative la viabilité de la culture de phase logarithmique riche en spirochètes et persiste de riches cultures stationnaires par rapport au contrôle (Fig. 2A et 2C2C: panneaux i-iii et ix-xi). Figure 2C: les panneaux i-iii et ix-xi ont démontré que la culture témoin B31, 1 x PBS stérile et 25% de cultures traitées à l’alcool ne comportaient que des cellules vivantes (vert).

 

Dans la prochaine série d’expériences, nous avons testé plusieurs antibiotiques efficaces précédemment signalés sur B. burgdorferi tels que la doxycycline, la cefoperazone et la daptomycine individuellement et en combinaison [30, 31].

La doxycycline, comme indiqué plus haut [30, 31], a été significativement capable de réduire la viabilité de la phase logarithmique B. burgdorferi de ~ 99% par rapport au témoin (figure 2A et 2C2C: panneau iv). Cependant, le traitement à la doxycycline n’a pas eu d’effet significatif sur les cellules dans les cultures en phase stationnaire, comme en témoigne la proportion croissante de cellules viables après exposition aux antibiotiques par rapport au témoin (figure 2A et 2C2C: panneau xii).

La cefoperazone à 10 μg / ml, identifiée auparavant comme l’un des médicaments ayant une activité élevée contre Borrelia persisters [30, 31], a considérablement réduit la viabilité de la phase logarithmique de Borrelia par ~ 99% (Fig. 2A et 2C2C: panneau V) mais, en revanche, seulement réduit la viabilité de la phase stationnaire de -18% par rapport au contrôle (figure 2A). Une grande population de formes rondes vivantes et un mélange de cellules spirochéales vivantes et mortes ont été observées dans une culture en phase stationnaire (figure 2C: panneau xiii).

La daptomycine, l’un des autres médicaments précédemment identifiés avec une activité puissante contre Borrelia persisters [30, 31], a également réduit de manière significative la culture en phase logarithmique enrichie en spirochetal de ~ 23%, mais elle était moins sensible pour réduire les cellules viables en phase stationnaire ( ~ 16% de réduction des cellules vivantes) par rapport au témoin (figure 2A). Les images ont démontré que les cellules traitées avec la daptomycine, à la fois en log et en phase stationnaire, montrent plus de cellules vivantes que les cellules mortes (figure 2C: panneaux vi et xiv) par rapport au contrôle.

Une étude récente a rapporté que la combinaison de la doxycycline, de la cefoperazone et de la daptomycine a éliminé avec succès les spirochètes et les persisters [30]. Nos données de cette étude ont également confirmé l’efficacité de cette combinaison de trois antibiotiques sur B. burgdorferi en éliminant de manière significative les spirochètes en phase logarithmique (effet 100%) et ont également considérablement réduit la viabilité de la culture de la phase stationnaire de ~ 86% (Fig. 2A et 2C2C: panneaux vii et xv).

Dans ces expériences, nous avons également testé l’agent antimicrobien potentiel Stevia A en tant qu’agent individuel et comparé son efficacité aux antibiotiques individuels et à la combinaison de trois antibiotiques. Dans la Fig. 2A et 2C2C: les panneaux viii et xvi, la stévia A a éliminé de manière significative les spirochètes en phase logarithmique et les phases persistantes de phase stationnaire par rapport au contrôle (effet 100% pour les deux). La phase logarithmique et la culture de phase stationnaire traitée avec Stevia A ne possèdent que des cellules mortes (figure 2C: panneaux viii et xvi).

Dans la Fig. 2A, l’efficacité de la doxycycline et la combinaison de trois antibiotiques a été comparée à la stévia A. Une élimination importante (valeur p ≤ 0,01) chez les patients a été trouvée avec la stévia A par rapport à la doxycycline.

Le comptage direct confirme l’efficacité de la stévia A sur les spirochètes en phase logarithmique et les résistances riches en phase stationnaire

Pour valider davantage l’efficacité des agents antimicrobiens évalués à l’aide du test SYBR Green I / PI, le comptage direct a été effectué comme décrit précédemment [7, 31].

Selon la méthode du comptage direct, les témoins négatifs, 1 x PBS stériles et 25% d’alcool, n’ont pas réduit de manière significative le nombre de cellules viables à la fois en phase logarithmique et en phase stationnaire par rapport au témoin (figure 2B). Alors que la doxycycline a considérablement réduit la viabilité de la phase logarithmique de Borrelia de ~ 98%, elle n’a pas réduit la viabilité de la phase stationnaire par rapport au contrôle (figure 2B). La cefoperazone a également été significativement capable de réduire la viabilité de la phase logarithmique Borrelia de ~ 99% (figure 2B), alors que la cefoperazone dans les cultures en phase stationnaire était moins efficace (~ 32% de réduction) dans l’élimination des persistants, comme en témoigne la proportion croissante de résidu Cellules viables après exposition aux antibiotiques par rapport au témoin (figure 2B et 2C2C: panneau xiii). La daptomycine a considérablement réduit la culture de la phase logarithmique enrichie en spirochetal par ~ 44% et a également considérablement réduit la phase stationnaire de ~ 42% par rapport au témoin (figure 2B). La combinaison à trois antibiotiques de la doxycycline, de la cefoperazone et de la daptomycine a éliminé de manière significative la culture en phase logarithmique et aussi la culture de la phase stationnaire de ~ 84% par rapport au témoin (figure 2B). L’agent antimicrobien puissant, la stévia A, a éliminé de manière significative les spirochètes en phase logarithmique et a considérablement réduit les persister par ~ 94% (figure 2B).

Dans la Fig. 2B, l’efficacité de la doxycycline et les combinaisons de trois antibiotiques a été comparée à la stévia A. Une réduction significative (valeur p ≤ 0,01) dans les persisters a été observée avec la stévia A par rapport à la doxycycline.

Efficacité de la stévia A après une sous-culture de 7 jours et 14 jours de B. burgdorferi traité aux antimicrobiens

Dans les expériences susmentionnées, nous avons démontré l’efficacité de la Stevia A sur les spirochètes et les persisters de Borrelia et nous avons fourni des données selon lesquelles son effet significatif est très comparable à la combinaison de trois antibiotiques précédemment signalée [31]. Pour confirmer l’efficacité de Stevia sur les persisters, nous avons effectué une expérience de sous-culture de 7 jours et 14 jours dans du nouveau BSK-H medium pour observer si les persisters, le cas échéant, encore laissés dans la culture, pourraient repousser dans un moyen frais testé par SYBR Green I / PI et les méthodes de comptage direct.

Comme prévu, le traitement avec des témoins négatifs, 1 × PBS et 25% d’alcool, a réussi à repeupler les médias avec des cellules vivantes vertes prédominantes similaires au contrôle B31 non traité après une sous-culture de 7 et 14 jours (figure 3A et 3C3C: panneaux i-iii et ix-xi). La combinaison de trois antibiotiques et la cefoperazone ont donné 5 à 7% de cellules viables après une sous-culture de 7 jours, mais il y avait une augmentation significative de 14% du nombre de cellules viables traitées avec de la cefoperazone et une augmentation de 11% dans les cellules viables traitées avec La combinaison de trois antibiotiques après une sous-culture de 14 jours (Fig. 3A et 3C3C: panneaux v, vii, xiii et xv). Il y a eu une augmentation significative de 13% et de 53% des cellules viables de l’échantillon traité avec doxycycline après une sous-culture de 7 jours et une sous-culture de 14 jours, respectivement (Fig. 3A et 3C3C: panneaux iv et xii). Cependant, le traitement avec la daptomycine a produit des cellules vivantes prédominantes après une sous-culture de 7 jours et 14 jours (Fig. 3A et 3C3C: panneaux vi et xiv). Il est intéressant de noter qu’il n’y avait pas de repousse avec l’échantillon traité avec la stévia A car il n’y avait que des cellules mortes (100% d’élimination) après une sous-culture de 7 jours, et seulement une augmentation de 10% des cellules viables a été observée après une sous-culture pendant 14 jours (Fig. 3A et 3C3C: panneaux viii et xvi).

N Fig. 3A, l’efficacité de la doxycycline et la combinaison de trois antibiotiques après une sous-culture de 7 jours et 14 jours a été comparée à la stévia A. Une réduction significative (valeur p ≤ 0,05) dans la repousse de Borrelia a été observée avec la stévia A par rapport à Doxycycline après une sous-culture de 14 jours.

Le comptage microscopique direct a confirmé l’essai SYBR Green I / PI et a montré que les témoins sans drogue et les témoins négatifs (1 × PBS et 25% d’alcool) ont bien augmenté dans les sous-cultures de 7 jours et 14 jours (figure 3B). Les échantillons traités avec doxycycline, la cefoperazone et la combinaison de trois antibiotiques ont produit 2% de cellules viables après 7 jours (figure 3B). La cefoperazone et la combinaison de trois antibiotiques ont produit 1% de cellules viables après une sous-culture de 14 jours (figure 3B). Cependant, il y a eu une augmentation des cellules viables de 68% traitées avec doxycycline après une sous-culture de 14 jours (figure 3B). Les cellules traitées par la daptomycine ont pu se rétablir mieux que les autres homologues d’antibiotiques avec une repousse semblable au contrôle sans médicament dans les sous-cultures de 7 et 14 jours (figure 3B). Les échantillons traités avec Stevia A après une sous-culture de 7 jours n’ont montré aucun signe de repousse et seulement 1% des cellules viables ont été observées après une sous-culture de 14 jours (figure 3B).

Dans la Fig. 3B, l’efficacité de la doxycycline et la combinaison de trois antibiotiques dans la méthode du comptage direct, après une sous-culture de 7 jours et de 14 jours, a été comparée à la stévia A. Une réduction significative (valeur p ≤ 0,01) dans la repousse de Borrelia était Trouvé avec la Stevia A par rapport à la doxycycline après une sous-culture de 14 jours.

Stevia A réduit considérablement les biofilms Borrelia cultivés sur des surfaces plastiques et collagènes

On a observé que diverses formes morphologiques de B. burgdorferi, c’est-à-dire la forme spirochale, les corps ronds et les biofilms, présentent différentes susceptibilités antimicrobiennes [7]. Dans notre publication précédente, nous avons caractérisé la sensibilité aux antibiotiques de la forme de biofilm de B. burgdorferi et a constaté qu’elle était la forme la plus résistante [7]. Dans cette étude, pour évaluer l’effet des agents antimicrobiens sur les biofilms de Borrelia cultivés sur des surfaces plastiques et de collagène, nous avons coloré les biofilms traités avec des antimicrobiens avec du cristal violet pour quantifier l’efficacité des différents agents antimicrobiens.

Les biofilms cultivés sur une surface plastique et traités avec des témoins négatifs, 1 × PBS ou 25% d’alcool, n’ont pas montré de réduction dans les masses de biofilm par rapport au contrôle du biofilm non traité (figure 4). Les biofilms traités avec la doxycycline, la cefoperazone, la daptomycine et la combinaison de trois antibiotiques ont montré une augmentation significative de la masse de biofilm Borrelia par rapport au contrôle sans médicament (figure 4). Cependant, le traitement avec la Stevia A a considérablement réduit les biofilms de Borrelia sur le plastique de -40% par rapport au témoin (figure 4).

La stévia A diminue la viabilité dans les biophages Borrelia attachés

Afin d’observer directement la viabilité des biofilms attachés après traitement antimicrobien, nous avons coloré les biélabies traités en utilisant un mélange de SYBR Green I et d’iodure de propidium (taches vivantes / mortes). Les biofilms Borrelia traités avec 1 × PBS et 25% d’alcool étaient grands et compacts, principalement colorés au vert, ce qui présentait que le biofilm était vivant (figure 5: panneaux ii et iii). Les biofilms traités avec la cefoperazone étaient significativement plus petits par rapport aux biofilms traités avec doxycycline, et les deux étaient verts avec de petites taches rouges indiquant qu’elles étaient vivantes (figure 5: panneaux iv et v). Les biophyses traitées avec la daptomycine étaient grandes et compactes et colorées principalement avec des cellules vivantes (figure 5: panneau vi), tandis que les biofilms traités avec la combinaison antibiotique étaient constitués d’un mélange de cellules vivantes et mortes avec des cellules vivantes prédominant (Fig. 5: panneau vii). Le traitement par biofilm Borrelia avec Stevia A coloré principalement en rouge, dépeignant que le biofilm avait principalement des spirochètes mortes et des corps ronds (figure 5: panneau viii). La morphologie du biofilm traité par Stevia A était petite et peu emballée par rapport aux biofilms traités avec des antibiotiques (figure 5: panneau viii).

L’analyse AFM montre une morphologie lâche avec des biofilms traités avec Stevia A

Les images microscopiques de la force atomique, rendues 3D et colorées numériquement pour une visualisation améliorée, montrent les caractéristiques ultra structurelles des biofilms avant et après traitement avec des agents antimicrobiens. La couleur rouge montre le pic le plus élevé dans les biofilms, ce qui indique principalement la présence potentielle de la matrice EPS du biofiltre. Le contrôle sans médicament avait une structure très compacte et rigide avec une accumulation notable d’EPS (figure 6: panneau i). Les biofilms traités avec de la doxycycline, de la cefoperazone, de la daptomycine et de la combinaison de trois antibiotiques étaient semblables à ceux du contrôle ayant une structure compacte avec plus de couches potentielles de EPS (figure 6: panneaux ii-v). Il est intéressant de noter que les biophages traités par Stevia ont une structure très lâche avec la couche EPS presque pas formée (figure 6: panneau vi).

 

La question évidente sur la façon dont Stevia pourrait affecter le biofilm Borrelia très résistant justifie une enquête plus approfondie. Dans une étude utilisant un alcool de sucre, on a signalé que le xylitol agit comme un agent antiplaque en perturbant la formation de biofilms dans la cavité buccale [54]. Dans une autre étude, ils ont montré que le xylitol affecte la production de polysaccharides adhésifs de Streptococcus mutans [55]. On a déjà montré que les sucres favorisent l’absorption d’antibiotiques chez Staphylococcus aureus et Escherichia coli [56]. Sur la base de ces résultats précédents, nous émettons l’hypothèse que la stévia pourrait agir comme un dérivé du sucre, qui pourrait favoriser l’absorption des phytochimiques responsables de l’effet antimicrobien et, par conséquent, perturber la structure du biofilm. En soutenant notre hypothèse, nous avons également montré que l’ultrastructure du biofilm traité à la Stevia A a une morphologie très lâche avec de grands puits peu profonds par rapport à la structure compacte des biofilms traités avec doxycycline, cefoperazone, daptomycine et la combinaison antibiotique (figure 6: Panneaux ii-vi).

Pour confirmer davantage l’efficacité de Stevia, nous avons effectué des expériences de sous-culture à long terme en utilisant la phase stationnaire antimicrobienne prédominée avec Borrelia persisters en transférant une population des cellules traitées dans un milieu de culture frais pour observer si les cellules viables peuvent repousser après 7 jours Et une période de 14 jours en l’absence d’agent antimicrobien. L’agent antimicrobien naturel (Stevia A) s’est révélé efficace sans croissance des cellules viables après une sous-culture de 7 jours et avec une augmentation de seulement 10% des cellules viables après une sous-culture de 14 jours. Les effets de la combinaison de trois antibiotiques par rapport à la stévia A ont entraîné une augmentation de 5% et 11% des cellules viables selon la méthode SYBR Green I / PI et confirmée par microscopie fluorescente (figure 3A et 3B3B: panneaux Vii, viii, xv et xvi). Nous avons également observé que Borrelia a traité avec de la doxycycline et de la cefoperazone, ce qui n’a pas montré d’effet significatif sur les persisters (figure 2A, 2B2B et 2C: les panneaux xii et xiii), en récupérant seulement 13% et 6% de cellules viables après Une sous-culture de 7 jours (figure 3A et 3C3C: panneaux iv et v). Une explication possible de ce phénomène pourrait être que la sensibilité aux antibiotiques aurait pu être restaurée lorsque les bactéries étaient dispersées à partir d’un biofilm pendant des conditions favorables [28].

La question évidente sur la façon dont Stevia pourrait affecter le biofilm Borrelia très résistant justifie une enquête plus approfondie. Dans une étude utilisant un alcool de sucre, on a signalé que le xylitol agit comme un agent antiplaque en perturbant la formation de biofilms dans la cavité buccale [54]. Dans une autre étude, ils ont montré que le xylitol affecte la production de polysaccharides adhésifs de Streptococcus mutans [55]. On a déjà montré que les sucres favorisent l’absorption d’antibiotiques chez Staphylococcus aureus et Escherichia coli [56]. Sur la base de ces résultats précédents, nous émettons l’hypothèse que la stévia pourrait agir comme un dérivé du sucre, qui pourrait favoriser l’absorption des phytochimiques responsables de l’effet antimicrobien et, par conséquent, perturber la structure du biofilm. En soutenant notre hypothèse, nous avons également montré que l’ultrastructure du biofilm traité à la Stevia A a une morphologie très lâche avec de grands puits peu profonds par rapport à la structure compacte des biofilms traités avec doxycycline, cefoperazone, daptomycine et la combinaison antibiotique (figure 6: Panneaux ii-vi).

L’extrait de feuille de stévia est un substitut de sucre largement utilisé [39-41, 57]; Cependant, des études récentes montrent que l’un des principaux glycosides, le stevioside, pourrait avoir un effet antimicrobien contre Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa [42]. Ces études antimicrobiennes ont utilisé une forte concentration de stvioside purifié et, dans notre étude, nous avons réalisé un effet antimicrobien similaire contre Borrelia en utilisant une concentration plus faible de l’extrait de feuille entier. Nos données avec le Stevioside purifié n’ont pas montré d’effet antimicrobien significatif sur les spirochètes et les persiennes de Borrelia par rapport aux extraits de feuilles entières de la Stevia (figure 1). Cette constatation suggère que d’autres composants dans l’extrait de feuille entier de Stevia pourraient avoir une activité antimicrobienne contre B. burgdorferi, qui doivent encore être identifiés dans des études futures. Dans un bon accord avec nos résultats, l’extrait de feuilles de Stevia a également démontré une activité antimicrobienne contre les agents pathogènes tels que E. coli, S. aureus, Vibrio mimicus, Salmonella typhimurium, S. mutans, Bacillus subtilis, Shigella dysenteriae et Vibrio cholera [38- 42]. La question suivante est de savoir si Stevia pourrait être utilisé en toute sécurité comme agent thérapeutique. Des études toxicologiques ont montré que la stévia n’a pas d’effets mutagènes, tératogènes ou cancérogènes [57], et des études récentes ont démontré sa sécurité à un taux élevé d’ingestion diététique [57-59]. Dans une étude portant sur la mutagénicité du Stevioside et du Steviol, on a noté que le Stevioside à 10 mg / ml n’a induit aucune mutation chez S. typhimurium [60]. Outre ces études, il existe deux études cliniques importantes basées sur les glycoprotéines présentes dans la Stevia. Dans une étude randomisée en double aveugle sur les hommes et les femmes chinois souffrant d’une hypertension légère, il a été signalé que le stéviose à la glycoprotéine a diminué la pression artérielle systolique et diastolique et a également amélioré la qualité de vie sans provoquer d’effets indésirables par rapport au placebo [44] . Dans une autre étude, les effets aigus du stéviose chez les patients diabétiques de type 2 ont été analysés [45]. Par rapport au groupe témoin, le stévioside réduit les taux de glucose sanguin postprandial chez les patients diabétiques de type 2 [45]. On a noté que ces deux études utilisaient une forme encapsulée en poudre de stéviose et d’extrait de feuille entière qui avait été prise par voie orale [44, 45]. On a également observé qu’une des études cliniques utilisait une préparation de feuilles entières, qui contenait 91% de stvioside, 4% de rebaudioside A et 5% d’autres dérivés du côté stévio [45]. Le résultat de ces études cliniques démontre que les patients n’ont rencontré aucun effet néfaste de l’utilisation du stéviose [44, 45]. Bien que la sécurité de la stévia soit largement étudiée, d’autres études in vivo sont justifiées avant que la stévia puisse être utilisée comme agent antimicrobien pour toute maladie infectieuse.

Notre objectif futur est d’étudier davantage les composants individuels de l’extrait de Stevia à feuilles entières contre B. burgdorferi et d’identifier le composant le plus efficace responsable de son effet antimicrobien significatif.

En conclusion,

L’efficacité antimicrobienne globale de l’extrait de Stevia A sur les différentes formes morphologiques de B. burgdorferi était comparable à la combinaison de certains antibiotiques. Bien que les résultats de cette étude préliminaire ne puissent pas être extrapolés directement à la pratique clinique, d’autres études de suivi sont nécessaires qui peuvent répondre à la sécurité de la stévia et pour identifier davantage le (s) composant (s) le plus efficace contre Borrelia.

 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4681354/


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