La lymphotoxine inhibe la croissance de Chlamydia pneumoniae dans les cellules HEp-2

Les cytokines telles que l’interféron gamma et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) inhibent la réplication intracellulaire de Chlamydia pneumoniae ou de Chlamydia trachomatis. Dans cette étude, nous avons trouvé qu’une autre cytokine, la lymphotoxine (TNF-β), limite la croissance de C. pneumoniae dans les cellules HEp-2. Lorsque la lymphotoxine (10 U / ml) a été ajoutée pendant l’incubation de 8 à 16 h après l’inoculation, la formation du corps d’inclusion a été sévèrement réduite. En outre, nous avons observé l’activation de la production d’oxyde nitrique et la transition nucléaire de NF-κB dans les cellules HEp-2 en réponse à la lymphotoxine. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la croissance de Chlamydia par la lymphotoxine est médiée, au moins en partie, par la transition nucléaire de NF-KB, ce qui entraîne l’induction de l’oxyde nitrique synthase pour produire de l’oxyde nitrique, un puissant agent bactériostatique. Ceci est le premier rapport sur l’activité antichlamydial de la lymphotoxine par induction de l’oxyde nitrique.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie intracellulaire obligatoire qui peut causer des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures chez les humains (15). En outre, l’infection par ce micro-organisme a été associée à des maladies inflammatoires chroniques telles que l’asthme  et l’athérosclérose. Des rapports récents sur l’isolement de C. pneumoniae à partir d’échantillons d’athérome de l’artère coronaire et d’athérome de l’artère carotide  impliquent davantage la bactérie en tant qu’agent causatif de l’athérosclérose.

Il a été démontré que diverses cytokines restreignent la croissance des pathogènes intracellulaires et sont des activateurs significatifs des réponses immunitaires des cellules hôtes aux infections. L’interféron gamma (IFN-γ) a été impliqué dans le contrôle chlamydial chez les humains et les animaux de laboratoire . La base biochimique de l’action antichlamydique de l’IFN-γ peut inclure l’induction d’enzymes intracellulaires comme l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) chez les rongeurs (22, 27) et l’indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO), qui à son tour active la cellule hôte catabolisme du tryptophane chez l’homme . En plus de l’IFN-γ, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est un médiateur de l’inflammation et joue un rôle dans la défense de l’hôte contre l’infection par C. trachomatis. Dans divers types cellulaires, IFN-γ et TNF-α activent iNOS, qui catalyse la conversion de la l-arginine en citrulline et oxyde nitrique (NO), un agent antimicrobien et tumoricide important ainsi qu’une molécule de signalisation cellulaire. Néanmoins, les rapports concernant les rôles relatifs de l’iNOS et d’autres mécanismes d’inhibition de la croissance intracellulaire de Chlamydia par les cytokines ont généralement été catégorisés selon qu’ils impliquaient des systèmes de rongeurs (iNOS) ou des systèmes humains (IDO).

La lymphotoxine (LT), une cytokine sécrétée par les macrophages activés et les lymphocytes , présente une homologie d’environ 30% dans sa séquence d’acides aminés avec le TNF-α. LT et TNF-a sont codés par des gènes étroitement liés qui sont inclus dans le complexe majeur d’histocompatibilité humaine, partagent un récepteur de surface cellulaire commun, p55 , et ont des activités biologiques similaires. Ainsi, LT a également été appelé TNF-β. En outre, TNF-a et LT activent tous deux un facteur de transcription nucléaire, NF-KB, dans des cellules U-937 de type macrophage humain. Dans la présente étude, nous avons testé si LT est également impliqué dans la croissance de C. pneumoniae. Nos résultats montrent que LT a une activité antichlamydial qui peut être médiée par la transition nucléaire de NF-κB, ce qui entraîne l’induction de iNOS. C’est le premier rapport que LT a une activité antichlamydiale et iNOS joue un rôle dans le système antichlamydial chez les humains.

Détermination de la croissance de Chlamydia.

On a laissé les cellules HEp-2 (ATCC CCL 23) adhérer à des plaques de culture tissulaire de 96 puits et on les a cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié d’Iscove (GIBCO) additionné de 5% de sérum de veau foetal et de gentamicine (50 ug / ml) pendant 72 h. utilisation.

C. pneumoniae TW183 (Washington Research Foundation, Seattle) a été passé, titré et stocké à -80 ° C jusqu’à utilisation. La suspension mère de Chlamydia a été diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate, et une aliquote de 0,2 ml (1,5 x 103 unités formant des inclusions [IFU]) a été ajoutée aux monocouches. L’infection a été établie par centrifugation (700 xg) à 22 ° C pendant 1 h, suivie d’une incubation à 36 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2 pendant 1 h. Ensuite, l’inoculum a été aspiré et remplacé par un milieu constitué du milieu de Dulbecco modifié d’Iscove, 10% de sérum de veau fœtal, de cycloheximide (1,5 ug / ml) et de gentamicine (50 ug / ml) (milieu CP). La LT a été purifiée à partir du surnageant de culture de cellules CHO transfectées avec de l’ADN génomique LT humain comme décrit précédemment.

Les cellules HEp-2 infectées cultivées dans du milieu CP ont été incubées avec de la LT pendant une période de 8 h avant ou après l’inoculation. A la fin de chaque période, les cellules ont été lavées une fois avec et placées dans du milieu CP frais préchauffé puis incubées pendant 48 h.

Les monocouches infectées ont été fixées pendant 15 min dans de l’éthanol à 95% et colorées avec un anticorps monoclonal spécifique de C. pneumoniae (dilution RR402: 400 fois, Washington Research Foundation) et des immunoglobulines anti-souris de chèvre marquées à l’isothiocyanate de fluorescéine (dilution 20 fois DAKO, Glostrup, Danemark). Les cellules ont été examinées au microscope à fluorescence à un grossissement de x 100 pour IFU, déterminé sur la base des nombres moyens de corps d’inclusion par champ déterminés à partir de trois champs par puits provenant d’échantillons en triple. Le pourcentage d’inhibition de la croissance de Chlamydia a été calculé [(IFU de contrôle) – (IFU de l’échantillon traité) / (IFU de contrôle)] x 100.

Les valeurs sont exprimées en tant que moyennes ± erreurs types de la moyenne des essais en triple. Les tests t non appariés de Student ont été utilisés pour évaluer la signification statistique des différences. Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

Ffect de LT sur la croissance de Chlamydia.

Des études ont été menées pour déterminer si la LT affecte l’infectiosité et / ou la réplication de C. pneumoniae dans les cellules HEp-2. L’incubation avec LT (10 U / ml) pendant 8 h de 0 à 8 h, 8 à 16 h ou 16 à 24 h après l’inoculation a réduit la croissance de C. pneumoniae à 48 h après l’inoculation de 70, 77 ou 62%, respectivement , alors qu’une faible inhibition a été observée par incubation avec LT pendant 8 h de 24 à 32 h, 32 à 40 h, ou 40 à 48 h après l’inoculation (Fig. La croissance de Chlamydia n’a pas été affectée lorsque les cellules HEp-2 ont été traitées avec LT pendant 8 h ou les micro-organismes chlamydia ont été traités avec LT pendant 1 h juste avant l’inoculation. Une courbe de titrage de LT sur la croissance de Chlamydia a révélé que LT à des concentrations supérieures à 10 U par ml inhibait la croissance (figure 1B) .1B). Puisque le l-tryptophane est connu pour sauver C. pneumoniae de l’effet bactériostatique de l’IFN-γ (38), nous avons testé si le tryptophane exogène réduisait l’inhibition de la croissance de Chlamydia induite par LT. Lorsque des cellules infectées par C. pneumoniae ont été incubées avec LT en l’absence ou en présence de diverses concentrations de l-tryptophane, la croissance de Chlamydia a été réduite de la même manière.

L’inhibition de l’IFU dans les transfectants était d’environ 80% à 36 h après l’inoculation (Fig. 2B), proche de celle des cellules HEp-2 incubées avec 10 U de LT par ml (Fig. .1B) .1B). Ces résultats suggèrent que la LT extracellulaire produite par les transfectants inhibe la croissance de Chlamydia, bien qu’il reste possible que la LT intracellulaire inhibe directement la croissance. Dans une expérience séparée, nous avons déterminé LT par un test de lyse de cellule L-M (ATCC CCL 1.2) . Les transfectants BHK-175 et BHK-110 produisent LT dans les surnageants de culture de 24 h à des niveaux de 64 à 128 et de 32 à 64 U par ml, respectivement, tandis que les cellules BHK-21 et HEp-2 non transfectées ne produisent pas de niveaux détectables de LT. . Ainsi, l’inhibition de la croissance de Chlamydia dans les cellules productrices de LT semble être inférieure à celle attendue des niveaux de LT produits, probablement en raison de la différence de réponse à la LT entre les cellules BHK et les cellules HEp-2. Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que les cellules sensibles à la chlamydia pourraient être transformées en cellules à faible susceptibilité en introduisant le gène LT.

Rôle du NO dans l’activité antichlamydiale de LT.

Puisque les cytokines antichlamydiales comme le TNF-α et l’IFN-γ induisent l’iNOS, nous avons testé si LT induisait aussi iNOS dans les cellules infectées. Les cellules HEp-2 ont été traitées par LT en présence d’acétate de N-guanidino-monométhyl-l-arginine (MLA, WAKO, Osaka, Japon), un inhibiteur spécifique de la NO synthase (24). Le cycloheximide a été omis du milieu lorsque le MLA a été ajouté. Les cellules ont été cultivées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits, infectées avec 1,5 x 103 IFU de C. pneumoniae par puits, et incubées à 36 ° C pendant 48 h. La production de NO a été évaluée en déterminant les concentrations de nitrite dans le surnageant de culture en utilisant le réactif de Griess comme décrit précédemment.

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Les niveaux de nitrite dans les surnageants des cellules HEp-2 non infectées ou infectées par C. pneumoniae ont augmenté de trois à cinq fois lorsque la LT a été ajoutée (figure 3A) .3A). Lorsque l’inhibiteur de la NO synthase MLA a été ajouté avec LT, les niveaux de nitrite ont été réduits à moins de 20%. Conformément à ces observations, la croissance de chlamydia inhibée par LT a été sauvée de manière significative en ajoutant du MLA (figure 3B) .3B). Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que LT présente une activité antichlamydiale, au moins en partie, en induisant une synthèse de NO. Ces résultats ont fourni des preuves initiales que l’iNOS joue un rôle dans le système antichlamydial chez l’homme.

Transition nucléaire de NF-κB dans des cellules HEp-2 traitées par LT.

Puisque l’induction de iNOS dépend de NF-κB activé pour le transport vers le noyau  nous avons déterminé l’effet de LT sur la transition nucléaire de NF-κB par une méthode indirecte avec un anticorps anti-NF-κB de lapin ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) et immunoglobuline anti-lapin de chèvre marquée à la fluorescéine. Lors d’un examen au microscope à fluorescence, les cellules HEp-2 traitées pendant 15 min avec LT à des concentrations de 7,25 à 116 U par ml ont montré une transition nucléaire significative de NF-κB, alors que les cellules traitées avec LT à des concentrations inférieures à 3,63 U par ml la transition nucléaire même après une incubation prolongée (données non présentées). Ces résultats suggèrent que le traitement par LT active NF-KB, qui à son tour peut activer iNOS.

Dans cette étude, nous avons montré que le traitement par LT des cellules HEp-2 infectées par C. pneumoniae réduisait nettement la formation de corps d’inclusion. L’inhibition la plus élevée a été observée lorsque la LT était présente pendant 8 h entre 8 et 16 h après l’inoculation (figure 1A), ce qui peut correspondre à la période de réplication de Chlamydia (5).

Des études antérieures ont démontré que l’IFN-γ ou le TNF-α réduit l’infectiosité chlamydiale in vitro. Cependant, il n’y a pas eu de rapport sur l’effet de la LT (TNF-β) sur l’infectivité à Chlamydia. De nombreuses cellules de mammifères montrent une sensibilité à LT ou expriment les récepteurs de LT (ou TNF). Les cellules BHK-21 expriment également le récepteur de LT , et les cellules HEp-2 réagissent à LT dans cette étude. LT ainsi que TNF-α et IFN-γ sont des activateurs puissants de NF-κB, un amplificateur transcriptionnel ainsi qu’un composant critique dans les voies de transduction du signal conduisant à l’induction de iNOS. Nous avons montré pour la première fois que LT induit efficacement iNOS in vitro dans des cellules HEp-2 soit sans ou avec une infection par C. pneumoniae (figure 3A) .3A). Puisque l’activité antichlamydiale de la LT a été partiellement supprimée par l’ajout de MLA, un inhibiteur de NO synthase (Fig. 3B), le NO semble jouer un rôle dans l’activité antichlamydiale. En outre, LT a induit la transition nucléaire de NF-κB dans les cellules HEp-2, suggérant que l’induction médiée par NF-κB de iNOS (42) est impliquée dans l’activité antichlamydiale.

Lorsque les cellules HEp-2 ont été traitées avec LT pendant 8 h juste avant l’inoculation de C. pneumoniae, l’infectiosité n’a pas été affectée (Fig. 1A), suggérant que la production de NO amorcée par le LT, même après l’élimination de LT, n’était pas suffisante pour supprimer l’infection. L’effet antichlamydial marqué de LT ajouté à la première période de 8 h peut être dû à l’inhibition de la phagocytose induite des corps élémentaires, à leur transformation en corps réticulés et / ou à l’initiation de la replication des corps réticulés. Cependant, il existe plusieurs explications tout aussi plausibles des effets antichlamydiens du NO, y compris l’inhibition de la réplication de l’ADN chlamydial et l’inhibition de la respiration des cellules hôtes .

Le tryptophane est un acide aminé essentiel pour les chlamydiae, et il a été suggéré que son pool intracellulaire diminue à la suite de la dégradation enzymatique par l’IDO induite par l’IFN-γ, entraînant une restriction de la croissance chlamydiale à un état persistant (3, 4). L’activité antichlamydiale de l’IFN-γ seul ou du TNF-α peut être supprimée par l’addition de tryptophane. En revanche, l’élévation des concentrations de tryptophane dans le milieu n’a pas affecté l’anti-C. activité pneumoniae de LT, comme indiqué dans cette étude. Par conséquent, nous avons conclu que l’induction d’IDO peut ne pas être une cause majeure de l’activité antichlamydial de LT observée dans cette étude.

Il convient de noter que l’addition de MLA n’a pas entraîné un blocage complet de l’activité antichlamydiale de LT  suggérant que l’induction de iNOS pourrait ne pas être le seul mécanisme d’inhibition de la croissance de Chlamydia. par LT. Des études récentes sur des souris knock-out iNOS ont indiqué que iNOS est dispensable pour l’élimination de C. trachomatis de l’épithélium génital. Il a été montré que le TNF-α induisait de faibles quantités d’ARNm pour l’IFN-β, un agent antiviral, dans les cellules HEp-2 . Nous avons évalué l’anti-C. l’activité pneumoniae d’autres cytokines, y compris l’IFN-a, l’IFN-ß, et le facteur stimulant les colonies de granulocytes, et ont trouvé que ces cytokines ne parvenaient pas à supprimer la croissance intracellulaire des chlamydiae (données non présentées). LT et TNF-a partagent une sous-unité de récepteur de surface commune, p55, mais le TNF-a nécessite en plus la sous-unité p75 pour sa liaison. Il est possible que ces cytokines exercent des effets antichlamydiens via différents mécanismes.

D’autres études sur la fonction de LT et le devenir intracellulaire de C. pneumoniae peuvent éclairer le mécanisme de l’infection persistante et conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques vers le traitement de l’athérosclérose médiée par l’infection à C. pneumoniae.

 

Sources

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC96642/

Cette étude a été financée par une subvention au titre de la recherche scientifique du Ministère de l’éducation, de la science, de la culture et des sports du Japon  et par une subvention de la Société japonaise pour la promotion des sciences


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