Test traitements antibiotiques sur l’infection chronique à Chlamydia pneumoniae

Télithromycine Traitement de l’infection chronique à Chlamydia pneumoniae chez la souris C57BL / 6J

Des infections chroniques à Chlamydia pneumoniae ont été associées à l’athérosclérose, mais il manque des connaissances claires sur la manière de traiter ces infections. Nous avons étudié l’effet d’un nouvel antibiotique cétolide, la télithromycine, sur l’infection pulmonaire chronique de C. pneumoniae. Des souris femelles C57BL / 6J soumises à un régime à 0,2% de cholestérol ont été inoculées par voie intranasale avec C. pneumoniae soit deux ou trois fois toutes les quatre semaines. La télithromycine a été administrée aux souris par voie sous-cutanée à 75 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 5 ou 10 jours, en commençant 3 jours après la dernière inoculation. Des échantillons ont été prélevés 4 et 12 semaines après la dernière inoculation. La présence d’ADN de C. pneumoniae dans le tissu pulmonaire a été démontrée par PCR et la détection de l’accumulation de lipides dans le sinus aortique par coloration Oil-Red-O. C. pneumoniae La positivité de l’ADN et les réactions inflammatoires dans le tissu pulmonaire des souris inoculées deux fois étaient significativement affectées par le traitement après les deux inoculations ou seulement après la deuxième inoculation à 12 semaines. L’accumulation de lipides intimes dans le sinus aortique était également légèrement mais significativement moins abondante chez les souris traitées après les deux inoculations que chez celles traitées seulement après la deuxième inoculation pendant 10 jours (moyennes géométriques, 823 et 4324 μm2, respectivement, P = 0,033 ). Aucune différence entre les témoins infectés non traités et le groupe inoculé trois fois et traité pendant 5 jours n’a été observée. Nous concluons que la télithromycine est efficace pour prévenir le développement d’une infection chronique à C. pneumoniae et l’accumulation de lipides intimaux chez les souris C56BL / 6J lorsque le traitement est administré après chaque inoculation.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie intracellulaire obligatoire qui provoque des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures. Semblable aux autres espèces de Chlamydia, il a tendance à provoquer des infections persistantes. Une infection persistante à C. pneumoniae a été associée à plusieurs maladies chroniques, telles que l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique  et la maladie coronarienne (CHD) , dans plusieurs études. C. pneumoniae est sensible aux macrolides et aux tétracyclines, qui sont couramment utilisés pour le traitement des infections aiguës à Chlamydia. Les fluoroquinolones, la rifampicine et, plus récemment, les cétolides se sont également révélés efficaces. À l’heure actuelle, la connaissance des thérapies réussies pour le traitement des infections latentes et persistantes est limitée. La définition et le développement de traitements appropriés efficaces et de moyens d’éradication de l’infection chronique par C. pneumoniae seraient cependant très importants, surtout si ces traitements s’avéraient avoir un effet sur le développement des maladies chroniques associées.

Des modèles animaux antérieurs ont montré que des inoculations répétées de Chlamydia augmentaient la présence et la persistance de l’ADN de Chlamydia dans plusieurs tissus de souris . Chlamydia. pneumoniae provoque également des modifications athéroscléreuses chez les lapins et les souris hyperlipidémiques, bien que des résultats controversés aient été publiés à partir d’études avec des modèles murins. En outre, il a été démontré qu’un traitement précoce des lapins infectés par C. pneumoniae avec des antibiotiques macrolides empêche le développement de l’athérosclérose, tandis que chez les souris déficientes en apolipoprotéine E, l’azithromycine ne diminue pas la progression des lésions lipidiques . Les deux premiers essais de traitement antibiotique à petite échelle avec des patients atteints de coronaropathie ont donné des résultats prometteurs concernant la diminution de l’incidence des événements cardiovasculaires. Dans une étude plus récente, des patients présentant un angor instable aigu ou un infarctus du myocarde sans onde Q ont été traités avec de la clarithromycine pendant 3 mois, ce qui a entraîné une réduction significative des événements cardiovasculaires pendant 555 jours en moyenne. Dans l’étude Azithromycine dans l’artériopathie coronaire: élimination du myocarde avec chlamydia (ACADEMIC), 3 mois de traitement par l’azithromycine chez des patients coronariens stables ont amélioré les marqueurs inflammatoires mais n’ont pas diminué les taux d’anticorps contre C. pneumoniae à 6 mois et n’a pas réduit les événements ischémiques au cours de la période de surveillance de deux ans. Très récemment, deux essais de traitement à l’azithromycine à grande échelle ont montré des résultats négatifs pour l’ensemble de la population: l’essai WIZARD comprenait 7 747 patients ayant déjà eu un infarctus du myocarde et des taux élevés d’anticorps contre C. pneumoniae et l’azithromycine chez les patients. L’étude du syndrome coronarien aigu (AZACS) a inclus 1 439 patients souffrant d’angor instable ou d’infarctus du myocarde (11). Les vastes essais en cours sur les antibiotiques et les patients atteints de coronaropathie peuvent fournir de nouvelles informations sur les effets préventifs possibles des antibiotiques sur les événements cardiovasculaires. D’autre part, d’autres modèles animaux sont nécessaires pour déterminer si les médicaments antimicrobiens peuvent éradiquer l’infection chronique à C. pneumoniae, établir l’effet du traitement antibiotique sur l’athérosclérose et déterminer le médicament optimal ou la combinaison de médicaments ainsi que le dosage et le moment de traitement.

Dans des études antérieures sur des souris, des inoculations multiples de C. pneumoniae ont provoqué seulement des réactions inflammatoires et aucun changement athérosclérotique dans les aortes ou les sinus aortiques de souris C57BL / 6J nourries de nourriture normale. Il a été démontré que les souris de cette souche sont sensibles à l’accumulation de lipides dans l’intima lorsqu’elles sont nourries avec un régime riche en graisses et en cholestérol, et avec ce type de régime, les inoculations de C. pneumoniae augmentent les risques d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous avons étudié le développement de l’infection chronique et des réactions inflammatoires chez les souris sans les effets confusionnels possibles d’un régime riche en graisses et des modifications génétiques. Par conséquent, nous avons utilisé des souris C57BL / 6J normales nourries à 0,2% de cholestérol pour étudier les effets d’un antibiotique cétolide, la télithromycine, sur le traitement et l’éradication des infections chroniques à C. pneumoniae et sur le développement de lésions lipidiques dans les sinus aortiques. souris.

Organisme et inoculum.

L’isolat de C. pneumoniae Kajaani 7 (K7), une souche épidémique finlandaise (15) cultivée dans des cellules HL, a été utilisé dans l’étude. Les cellules infectées ont été récoltées avec des billes de verre stériles et perturbées par ultrasonication. Les débris cellulaires ont été séparés par centrifugation à basse vitesse, suivie d’une sonication et de deux cycles de centrifugation à grande vitesse, pour purifier les particules de Chlamydia. Finalement, le culot obtenu a été remis en suspension dans du tampon saccharose-phosphate-acide glutamique pour le stockage. Le nombre d’unités de formation d’inclusion (IFU) d’organismes viables par millilitre a été déterminé par culture dans des cellules HL. Brièvement, les cellules HL ont été infectées avec des dilutions de 10 fois de la culture mère de Chlamydia par centrifugation et incubées à 35 ° C dans 5% de C02 pendant 72 h. Le milieu de culture (RPMI 1640) contenait 7% de sérum fœtal bovin, 1% de l-glutamate, 20 ug de streptomycine par ml et 0,5 ug de cycloheximide par ml. La dose d’inoculum a été estimée sur cette base et la dose infectieuse administrée aux animaux a été confirmée par culture dans des cellules HL, comme décrit ci-dessus.

Modèle animal et traitement.

Des souris C57BL / 6J consanguines femelles de six semaines ont été achetées auprès de M & B A / S, Ry, Danemark. Une alimentation normale (1324, Altromin, Lage, Danemark) avec un supplément de 0,2% de cholestérol a été commencée lorsque les animaux sont arrivés dans les installations. Après 2 semaines d’un régime supplémenté en cholestérol, chaque souris a été inoculée par voie intranasale avec 1,05 x 106 IFU de C. pneumoniae K7 tandis que la souris était sous anesthésie au méthoxyflurane inhalé (Metofane, Schering-Plough, Bloomfield, N.J.). Une ou deux réinfections ont été administrées de la même manière 4 semaines (dose, 1,77 × 106 IFU / souris) et 8 semaines (dose, 2,2 × 106 IFU / souris) après l’inoculation primaire.

La télithromycine a été administrée aux souris par voie sous-cutanée à 75 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 5 ou 10 jours, en commençant le troisième jour après l’inoculation intranasale. La télithromycine a été dissoute avec de l’acide acétique glacial et ensuite diluée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (concentration finale d’acide acétique, 0,1%). La dose de télithromycine utilisée a été choisie sur la base d’études préliminaires (52), dans lesquelles des doses de 25, 50 et 100 mg / kg pour le traitement de l’infection pulmonaire aiguë à C. pneumoniae ont été testées. Des doses de télithromycine de 50 et 100 mg / kg ont également été utilisées chez d’autres modèles murins (43, 51), et des doses aussi élevées sont apparemment nécessaires chez les souris ayant des taux métaboliques et d’élimination élevés pour obtenir de bonnes réponses thérapeutiques. Auparavant, Bonnefoy et al. (8) a été capable de mesurer les niveaux de télithromycine pendant 8 h après l’administration intraveineuse ou orale de 10 mg de médicament par kg à des souris suisses, et la demi-vie était de 1,2 h par voie intraveineuse.

Les souris ont été divisées en trois groupes de traitement et deux groupes de contrôle de placebo, avec 20 souris dans chaque groupe. Les groupes 1 et 2 ont été inoculés deux fois avec la chlamydia. Le groupe 1 a été traité pendant 10 jours après les deux inoculations, et le groupe 2 a été traité pendant 10 jours après la dernière inoculation, c’est-à-dire après l’infection (p.i.). Le groupe placebo (groupe 3) a reçu du diluant après les deux inoculations. Le groupe 4 a été inoculé trois fois et n’a été traité qu’après la dernière inoculation pendant 5 jours (bien que l’intention ait été de les traiter pendant 10 jours). L’autre groupe placebo (groupe 5) a été inoculé trois fois et a reçu un diluant après la dernière inoculation pendant 5 jours, similaire au groupe 4. Des échantillons ont été prélevés à 4 et 12 semaines p.i. Les schémas d’inoculation et de traitement sont également présentés sur la Fig. Le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut national de santé publique, Helsinki, Finlande, a approuvé toutes les procédures impliquant des animaux.

Mesure des titres d’anticorps contre C. pneumoniae.

Les titres d’anticorps ont été mesurés par le test de micro-immunofluorescence (décrit à l’origine ailleurs [55]) en utilisant des corps élémentaires entiers purifiés fixés au formol de K7 comme antigène. Les anticorps anti-immunoglobulines G (IgG) ont été détectés dans le sérum en utilisant des fragments [F (ab ‘) 2 d’IgG anti-souris conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine; Serotec].

Culture du tissu pulmonaire.

Les lobes du poumon droit ont été homogénéisés mécaniquement dans 2 ml de tampon saccharose-phosphate-acide glutamique. Les suspensions tissulaires ont été centrifugées pour éliminer les débris, et le surnageant a été recueilli et congelé à -70 ° C. Les débris de tissu pulmonaire restants ont été stockés pour la détection de l’ADN de C. pneumoniae. Les poumons des souris ont été dosés à 4 semaines p.i. pour la présence d’organismes viables de C. pneumoniae. Toutes les analyses ont été effectuées en double exemplaire. Des cellules HL infectées avec différentes dilutions des homogénats ont été centrifugées à 490 xg pendant 1 h et incubées à 35 ° C sous 5% de C02 pendant 72 h, après quoi les plaques ont été centrifugées de nouveau comme décrit ci-dessus, de nouveaux milieux de culture ont été ajoutés et les cultures ont été cultivées pendant 72 heures supplémentaires. Finalement, les cellules ont été lavées avec une solution de PBS, fixées avec du methanol et colorées avec un anticorps monoclonal spécifique du genre Chlamydia conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (Pathfinder, Sanofi Diagnostics Pasteur, Redmond, Wash.).

Détection de l’ADN de C. pneumoniae dans les tissus pulmonaires.

Des débris de tissu pulmonaire (50 mg) ont été lysés avec de la protéinase K (Qiagen) dans du tampon de lyse tissulaire (Qiagen). Après incubation à 56 ° C pendant une nuit, l’ADN a été purifié avec un kit de tissu QIAamp disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant (Qiagen). L’ADN purifié a été maintenu congelé à -20 ° C. Les amorces de PCR ont été synthétisées à l’Institute of Biotechnology, Helsinki, Finlande. Les séquences pour les amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN (produit de 135 pb), l’amorce HB1 (5’-ATAGTCTCCGTAAAATCCAGCACG-3 ‘) et l’amorce biotinylée HB2 (5′-CCTGTAGGGAACCCTTCTGATC-3′) proviennent du gène C. pneumoniae omp1 . La PCR a été réalisée avec un mélange de 400 μM de désoxynucléoside triphosphate, 4,0 mM de MgCl2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 100 mM de NaCl, 0,1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol, 50% de glycérol, 1% de Triton X-100, 1,0 U de Taq polymérase (PromegaTag), 50 pmol de chaque amorce, et 10 ul d’ADN isolé à partir d’échantillons cliniques. Le volume réactionnel total était de 50 ul. Après 5 min de dénaturation à 94 ° C, les échantillons ont été soumis à 50 cycles de dénaturation (94 ° C, 30 s), hybridation (55 ° C, 30 s) et extension (72 ° C, 30 s) avec un Thermocycleur Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600. Un essai d’hybridation par fluorescence à résolution temporelle avec une sonde d’hybridation marquée à l’Eu (5’-CCATATTGTACCATCAATTAA-3 ‘) (2 ng / 100 μl) a été utilisé pour tester la présence du produit de PCR spécifique de C. pneumoniae. La sonde a été incubée pendant une nuit à 37 ° C et la réaction a été arrêtée en lavant le mélange réactionnel 10 fois. Sinon, le test a été effectué comme décrit précédemment (44). La limite de détection du test de PCR est de 0,8 équivalent-génome. Tous les échantillons positifs dans la première série ont été testés deux fois, et le résultat a été considéré comme positif seulement si le résultat était le même dans les deux séries.

Détection de l’ADN de C. pneumoniae dans les tissus pulmonaires.

Des débris de tissu pulmonaire (50 mg) ont été lysés avec de la protéinase K (Qiagen) dans du tampon de lyse tissulaire (Qiagen). Après incubation à 56 ° C pendant une nuit, l’ADN a été purifié avec un kit de tissu QIAamp disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant (Qiagen). L’ADN purifié a été maintenu congelé à -20 ° C. Les amorces de PCR ont été synthétisées à l’Institute of Biotechnology, Helsinki, Finlande. Les séquences pour les amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN (produit de 135 pb), l’amorce HB1 (5’-ATAGTCTCCGTAAAATCCAGCACG-3 ‘) et l’amorce biotinylée HB2 (5′-CCTGTAGGGAACCCTTCTGATC-3′) proviennent du gène C. pneumoniae omp1 . La PCR a été réalisée avec un mélange de 400 μM de désoxynucléoside triphosphate, 4,0 mM de MgCl2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 100 mM de NaCl, 0,1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol, 50% de glycérol, 1% de Triton X-100, 1,0 U de Taq polymérase (PromegaTag), 50 pmol de chaque amorce, et 10 ul d’ADN isolé à partir d’échantillons cliniques. Le volume réactionnel total était de 50 ul. Après 5 min de dénaturation à 94 ° C, les échantillons ont été soumis à 50 cycles de dénaturation (94 ° C, 30 s), hybridation (55 ° C, 30 s) et extension (72 ° C, 30 s) avec un Thermocycleur Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600. Un essai d’hybridation par fluorescence à résolution temporelle avec une sonde d’hybridation marquée à l’Eu (5’-CCATATTGTACCATCAATTAA-3 ‘) (2 ng / 100 μl) a été utilisé pour tester la présence du produit de PCR spécifique de C. pneumoniae. La sonde a été incubée pendant une nuit à 37 ° C et la réaction a été arrêtée en lavant le mélange réactionnel 10 fois. Sinon, le test a été effectué comme décrit précédemment (44). La limite de détection du test de PCR est de 0,8 équivalent-génome. Tous les échantillons positifs dans la première série ont été testés deux fois, et le résultat a été considéré comme positif seulement si le résultat était le même dans les deux séries.

Statistiques.

Le test non paramétrique de Mann-Whitney U a été utilisé pour des analyses statistiques des zones d’accumulation de lipides. La positivité PCR a été testée par le test du chi carré de Pearson ou le test exact de Fisher, selon le cas, et les résultats de l’histopathologie pulmonaire ont été testés par le test du chi carré pour la tendance (SPSS pour Windows, version 10.0.5). Les valeurs exactes de P ont été rapportées comme appropriées.

RÉSULTATS

Observations cliniques.

Aucun symptôme d’infection respiratoire n’a été détecté chez les souris inoculées avec la chlamydia, et les souris dans tous les groupes ont pris du poids régulièrement tout au long de l’étude. Pour une raison inconnue, les souris inoculées trois fois et traitées seulement après la dernière inoculation ont eu une irritation cutanée et ont développé des plaies aux sites d’injection sur leur cou. L’irritation et les lésions cutanées ont été détectées principalement dans les groupes traités par télithromycine, mais elles ont également été détectées dans une certaine mesure dans les groupes placebo. Pour cette raison, le traitement de ces groupes a dû être terminé après 5 jours, après quoi les plaies cicatrisent rapidement. Par conséquent, le temps de traitement pour ces souris (groupe 4) après la dernière inoculation était de seulement 5 jours, alors qu’il était de 10 jours dans les groupes de souris (groupes 1 et 2) inoculés deux fois.

Sérologie

Toutes les souris avaient des titres d’anticorps> 128, mesurés par la méthode de micro-immunofluorescence. A 4 semaines pi, les souris inoculées deux fois et traitées après les deux inoculations avaient des titres d’anticorps significativement plus élevés (moyenne géométrique des titres par groupe d’étude, 987) que le groupe placebo (titre moyen 530) (P = 0,025, test U de Mann-Whitney) ). A 12 semaines p.i., les titres correspondants dans ces deux groupes étaient de 630 et 461, mais la différence n’était plus statistiquement significative.

Culture de C. pneumoniae et détection de l’ADN du tissu pulmonaire.

Tous les homogénats de tissu pulmonaire des échantillons prélevés à 4 semaines p.i. étaient culture négative. La méthode d’hybridation que nous avons utilisée avec la PCR a donné une valeur quantitative pour la quantité d’ADN amplifié dans le produit de PCR, mais pas directement pour la quantité d’ADN d’origine dans l’échantillon. Pour cette raison, nous avons comparé les groupes uniquement sur la base de résultats positifs et négatifs. Les valeurs positives se réfèrent donc au nombre de souris ADN-positives par groupe, exprimé en pourcentage. Les valeurs de positivité de l’ADN de C. pneumoniae à 4 et 12 semaines p.i. pour les souris recevant différents traitements sont représentés sur la Fig. Fig.2.2. Chez les souris inoculées deux fois, les taux de positivité de l’ADN diminuent significativement de 4 à 12 semaines p.i. dans les deux groupes de traitement, alors que la diminution dans le groupe traité par placebo n’était pas significative. Le traitement administré après les deux inoculations était le plus efficace, avec seulement 10% (2 sur 20) des souris restant positives pour la PCR. Chez les souris inoculées trois fois, le traitement après la dernière inoculation n’a pas significativement diminué le taux de positivité de l’ADN, et dans le groupe témoin traité par placebo, le taux de positivité a même augmenté légèrement entre 4 et 12 semaines p.i. (42 et 59%, respectivement). Le nombre d’échantillons avec des résultats discordants (échantillons positifs au premier tour d’analyse et négatifs au second tour) était de 6 sur 60 (10%) échantillons (à l’exclusion des échantillons avec des résultats négatifs) à 4 semaines p.i. et, de même, 19 échantillons sur 54 (35%) à 12 semaines p.i.

Histopathologie pulmonaire.

Aucun changement inflammatoire marqué ou sévère (grades 3 et 4, respectivement), qui sont fréquemment présents au cours de l’infection aiguë C. pneumoniae chez les souris, ont été détectés dans cette étude. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes à 4 semaines p.i. (résultats non montrés), mais à 12 semaines pi, un traitement précoce par la télithromycine a nettement diminué le niveau d’inflammation dans les poumons des souris: une réaction inflammatoire modérée (grade 2) était présente chez 50% des souris non traitées, 11% des ceux traités seulement après la dernière inoculation, et 5% des souris traitées après les deux inoculations (P = 0,009, test du chi carré pour la tendance) (Tableau (Tableau 1) .1). Les traitements administrés après les trois inoculations n’ont eu aucun effet sur les réactions inflammatoires dans les poumons. Lorsque les scores d’histopathologie pulmonaire ont été comparés aux taux de positivité PCR pour les souris traitées à la télithromycine, plus de souris positives à l’ADN ont été observées chez les souris avec histologie 1 et 2 aux deux moments, et les tendances étaient statistiquement significatives (P = 0,017 à 4 semaines pi et P = 0,031 à 12 semaines pi, test du chi carré pour la tendance) (Fig. (Fig.3B) .3B). Pour les souris témoins traitées par placebo, une tendance significative a été observée seulement à 4 semaines p.i. (P = 0,043, test du chi-carré pour la tendance) (Fig. (Fig.3A3A).

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DISCUSSION

Dans cette étude, nous avons montré que le traitement par télithromycine supprime la réaction inflammatoire pulmonaire, réduit le nombre de souris positives pour l’ADN de C. pneumoniae (poumons) et affecte l’accumulation de lipides dans le sinus aortique chez les souris C57BL / 6J avec des infections chlamydiennes chroniques. est donné après chaque inoculation. Le traitement après les deux inoculations diminue significativement le taux d’ADN de C. pneumoniae chez la souris à 12 semaines pi, mais l’ADN reste détectable dans le tissu pulmonaire, malgré le traitement: à 3 mois pi, les tissus pulmonaires de 10% des souris inoculées et traitées deux fois , 28% de ceux inoculés deux fois et traités une fois après la dernière inoculation, et 60% de ceux inoculés trois fois et traités seulement après la dernière inoculation étaient PCR positifs. Les proportions de résultats discordants détectés par analyse PCR étaient de 10% à 4 semaines p.i. et 35% à 12 semaines p.i. Le pourcentage élevé d’incohérence à 12 semaines peut être en partie dû à la très faible quantité d’ADN chlamydial présent, ce qui entraîne des problèmes de sensibilité. Répétitions de toutes les analyses plus d’une fois aurait probablement donné des résultats encore plus précis.

En accord avec nos résultats, il a été démontré dans une étude précédente (5) que l’ADN chlamydial persiste pendant 2 mois dans 38% des tissus pulmonaires de souris NMRI inoculées une fois et traitées pendant 7 jours avec une combinaison d’azithromycine et de rifampine tôt après la infection. Dans une autre étude, l’ADN chlamydial est resté détectable pendant 26 semaines chez la moitié des souris déficientes en ApoE inoculées deux fois et a reçu un traitement retardé avec deux doses d’azithromycine (47). Une étude récente chez l’homme a montré que la persistance de l’ADN de C. pneumoniae dans les écouvillons nasopharyngés était corrélée à la persistance des symptômes (35). Certains patients peuvent présenter des infections persistantes et des symptômes prolongés ou des rechutes avec des résultats positifs de culture et / ou de PCR et peuvent ne pas être guéris par un traitement conventionnel pendant 7 à 21 jours (16, 26, 35, 46); même un traitement prolongé a été inefficace dans certains cas (16).

Les souris C57BL / 6J utilisées dans l’étude se sont révélées sensibles à l’infection chlamydienne, ce qui entraîne une pneumonie auto-restreinte (54, 57). Après inoculation secondaire, la plupart des chlamydiae sont éradiquées en 3 à 4 semaines chez ces souris (54), mais comme indiqué ci-dessus, la persistance de l’ADN bactérien est détectée chez certains animaux. Conformément à cela, nous n’avons trouvé aucune chlamydia viable dans le tissu pulmonaire par culture à 4 semaines p.i., et une infection réussie a été confirmée par des titres élevés d’anticorps IgG de C. pneumoniae. On s’est demandé si la présence d’ADN de Chlamydia pouvait être considérée comme un indicateur d’une infection chronique persistante. Antérieurement, l’infection persistante par C. pneumoniae, culture négative, chez la souris, démontrée en tant que PCR positive du tissu pulmonaire après l’inoculation primaire, s’est révélée être réactivée par un traitement immunosuppresseur à la cortisone (32, 33). Dans la présente étude, des souris non traitées inoculées trois fois ont montré une légère augmentation de la positivité PCR pendant 8 semaines de surveillance (entre 4 et 12 semaines p.i.), et seulement une diminution marginale a été observée dans un groupe traité par télithromycine. La persistance de la positivité PCR a été observée moins souvent chez les souris n’ayant reçu que deux inoculations. Ceci est en accord avec les résultats d’études antérieures (36), qui ont montré que la persistance de l’ADN augmente avec des inoculations répétées. L’histopathologie pulmonaire a détecté une réaction inflammatoire modérée (grade 2) chez 50 et 42% des souris dans les groupes inoculés avec C. pneumoniae deux et trois fois, respectivement, et traitées avec un placebo à 12 semaines p.i. Dans nos études préliminaires, l’inflammation de grade 2 n’a pas été observée chez des souris C57BL / 6J inoculées simulées du même âge (L. Törmäkangas, M. Leinonen et P. Saikku, données non publiées). De plus, dans les groupes traités par la télithromycine et les groupes non traités, la positivité de la PCR était nettement plus fréquente chez les souris présentant une inflammation des poumons de grade 1 et 2 que chez celles n’ayant pas d’inflammation. Ces résultats suggèrent la présence continue d’une forme chronique et non cultivable de chlamydia qui maintient l’inflammation dans le tissu pulmonaire. Des études in vitro ont montré que C. pneumoniae est capable de persister dans un état métaboliquement actif et viable dans les monocytes et macrophages humains avec un développement restreint de descendance infectieuse (2) et d’induire une infection persistante non réplicative mais viable lorsqu’elle est exposée à l’interféron gamma stimulation (4). In vivo, des macrophages alvéolaires et péritonéaux provenant de souris inoculées se sont révélés capables de transmettre l’infection à des souris non infectées (37) et C. pneumoniae est fréquemment trouvé dans les cellules mononucléaires circulantes dans des échantillons de sang périphérique humain (50). De plus, Gieffers et al. (20) et Yamaguchi et al. (56) ont récemment montré que des isolats de C. pneumoniae inoculés dans des monocytes humains circulants (20) et des lymphocytes primaires de souris (56) sont résistants à un traitement antibiotique.

Le moment du traitement semble avoir une influence sur le développement de l’infection chronique et des lésions athérosclérotiques. Dans une étude précédente, Rothstein et al. (47) ont traité des souris déficientes en ApoE qui avaient été inoculées deux fois avec une dose orale d’azithromycine à 2 et 3 semaines p.i. A l’âge de 26 semaines, c’est-à-dire 12 semaines p.i., l’infection par C. pneumoniae a augmenté la taille des lésions colorées à l’huile rouge-rouge aortique chez les souris infectées, mais l’azithromycine n’a pas réduit leur taille (47). Le retard dans le début du traitement vu dans l’étude de Rothstein et al. (47) peut avoir causé le résultat négatif. Cet effet a également été démontré dans des modèles de lapin par Muhlestein et al. (39) et Fong et al., Qui ont inoculé les lapins trois fois et les ont traités avec de l’azithromycine (17) ou de la clarithromycine (17, 19). Dans les deux dernières études (17, 19), le traitement tardif à la clarithromycine a légèrement diminué la zone de développement des lésions athéroscléreuses, alors que tous les traitements précoces dans les trois études étaient significativement efficaces pour diminuer les zones lésées.

Les souris C57BL / 6J utilisées dans l’étude se sont révélées sensibles à l’infection chlamydienne, ce qui entraîne une pneumonie auto-restreinte (54, 57). Après inoculation secondaire, la plupart des chlamydiae sont éradiquées en 3 à 4 semaines chez ces souris (54), mais comme indiqué ci-dessus, la persistance de l’ADN bactérien est détectée chez certains animaux. Conformément à cela, nous n’avons trouvé aucune chlamydia viable dans le tissu pulmonaire par culture à 4 semaines p.i., et une infection réussie a été confirmée par des titres élevés d’anticorps IgG de C. pneumoniae. On s’est demandé si la présence d’ADN de Chlamydia pouvait être considérée comme un indicateur d’une infection chronique persistante. Antérieurement, l’infection persistante par C. pneumoniae, culture négative, chez la souris, démontrée en tant que PCR positive du tissu pulmonaire après l’inoculation primaire, s’est révélée être réactivée par un traitement immunosuppresseur à la cortisone (32, 33). Dans la présente étude, des souris non traitées inoculées trois fois ont montré une légère augmentation de la positivité PCR pendant 8 semaines de surveillance (entre 4 et 12 semaines p.i.), et seulement une diminution marginale a été observée dans un groupe traité par télithromycine. La persistance de la positivité PCR a été observée moins souvent chez les souris n’ayant reçu que deux inoculations. Ceci est en accord avec les résultats d’études antérieures (36), qui ont montré que la persistance de l’ADN augmente avec des inoculations répétées. L’histopathologie pulmonaire a détecté une réaction inflammatoire modérée (grade 2) chez 50 et 42% des souris dans les groupes inoculés avec C. pneumoniae deux et trois fois, respectivement, et traitées avec un placebo à 12 semaines p.i. Dans nos études préliminaires, l’inflammation de grade 2 n’a pas été observée chez des souris C57BL / 6J inoculées simulées du même âge (L. Törmäkangas, M. Leinonen et P. Saikku, données non publiées). De plus, dans les groupes traités par la télithromycine et les groupes non traités, la positivité de la PCR était nettement plus fréquente chez les souris présentant une inflammation des poumons de grade 1 et 2 que chez celles n’ayant pas d’inflammation. Ces résultats suggèrent la présence continue d’une forme chronique et non cultivable de chlamydia qui maintient l’inflammation dans le tissu pulmonaire. Des études in vitro ont montré que C. pneumoniae est capable de persister dans un état métaboliquement actif et viable dans les monocytes et macrophages humains avec un développement restreint de descendance infectieuse (2) et d’induire une infection persistante non réplicative mais viable lorsqu’elle est exposée à l’interféron gamma stimulation (4). In vivo, des macrophages alvéolaires et péritonéaux provenant de souris inoculées se sont révélés capables de transmettre l’infection à des souris non infectées (37) et C. pneumoniae est fréquemment trouvé dans les cellules mononucléaires circulantes dans des échantillons de sang périphérique humain (50). De plus, Gieffers et al. (20) et Yamaguchi et al. (56) ont récemment montré que des isolats de C. pneumoniae inoculés dans des monocytes humains circulants (20) et des lymphocytes primaires de souris (56) sont résistants à un traitement antibiotique.

Le moment du traitement semble avoir une influence sur le développement de l’infection chronique et des lésions athérosclérotiques. Dans une étude précédente, Rothstein et al. (47) ont traité des souris déficientes en ApoE qui avaient été inoculées deux fois avec une dose orale d’azithromycine à 2 et 3 semaines p.i. A l’âge de 26 semaines, c’est-à-dire 12 semaines p.i., l’infection par C. pneumoniae a augmenté la taille des lésions colorées à l’huile rouge-rouge aortique chez les souris infectées, mais l’azithromycine n’a pas réduit leur taille (47). Le retard dans le début du traitement vu dans l’étude de Rothstein et al. (47) peut avoir causé le résultat négatif. Cet effet a également été démontré dans des modèles de lapin par Muhlestein et al. (39) et Fong et al., Qui ont inoculé les lapins trois fois et les ont traités avec de l’azithromycine (17) ou de la clarithromycine (17, 19). Dans les deux dernières études (17, 19), le traitement tardif à la clarithromycine a légèrement diminué la zone de développement des lésions athéroscléreuses, alors que tous les traitements précoces dans les trois études étaient significativement efficaces pour diminuer les zones lésées.

A notre connaissance, le modèle murin décrit ici est le premier à démontrer que le traitement antimicrobien affecte la formation de lésions lipidiques du sinus aortique chez des souris infectées par C. pneumoniae. Les résultats doivent être interprétés avec prudence en raison du large éventail de zones de lésions dans chaque groupe. Malgré la variabilité, l’effet du traitement était statistiquement significatif lorsque la télithromycine était administrée après chaque inoculation par rapport à l’effet obtenu lorsque les souris étaient traitées seulement après la deuxième inoculation dans les groupes inoculés deux fois. Cependant, aucune différence statistique n’a été observée lorsque les résultats du groupe traité deux fois ont été comparés à ceux du groupe témoin traité par placebo. Il est regrettable que le traitement des souris inoculées trois fois doive être interrompu après 5 jours en raison d’une irritation de la peau et que les effets d’un traitement de 10 jours sur l’accumulation de lipides ne puissent pas être évalués pour ce groupe. Les inconvénients de notre étude sont que nous n’étions pas en mesure d’évaluer les sinus aortique, où les lésions ont été détectées, la présence de l’antigène chlamydia, ni  nous n’avons un groupe témoin non infecté permettant de comparer les résultats pour les inoculées, les animaux non traités . Nous ne pouvons donc pas estimer l’influence directe des chlamydiaes sur le développement des lésions athéroscléreuses. Les inoculations répétées ont clairement augmenté la persistance du pathogène dans le tissu pulmonaire, et le traitement a diminué ce développement dans le groupe traité deux fois, mais des études supplémentaires avec plus de souris sont nécessaires pour vérifier les résultats d’accumulation de lipides et déterminer si les niveaux diminuent. Le modèle de souris était vraiment dû à l’effet antichlamydial de la télithromycine.

Les antibiotiques macrolides, en particulier les dérivés semi-synthétiques de l’érythromycine A (comme la clarithromycine et la roxithromycine), possèdent plusieurs propriétés anti-inflammatoires (28, 30, 48). Structurellement, la télithromycine est dérivée de l’érythromycine A (14), mais il n’y a pas de rapports sur les effets anti-inflammatoires potentiels de la télithromycine. Dans notre étude, certaines souris se sont révélées positives à la PCR même lorsqu’aucune inflammation n’a été détectée dans le tissu pulmonaire des groupes traités par télithromycine, alors qu’aucun ADN chlamydial n’a été détecté dans le tissu pulmonaire des souris non traitées sans inflammation. Cela peut être dû à un effet anti-inflammatoire de la télithromycine. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l’accumulation réduite de lipides dans les groupes de traitement soit également due à l’effet anti-inflammatoire, bien que le traitement ait intensifié la réponse de l’anticorps IgG à C. pneumoniae. Fong et al. (19) ont suggéré que l’action anti-inflammatoire de la clarithromycine n’était pas très marquée chez les lapins, car chez les lapins nourris au cholestérol non infectés, la diminution du développement des lésions athéroscléreuses observées après le traitement à la clarithromycine était mineure comparée à celle observée chez les chlamydia-inoculés. lapins.

Le fait que seul un traitement administré tôt après l’infection semble efficace pour prévenir le développement d’une infection chronique et réduire l’athérosclérose accélérée par l’infection dans des modèles animaux devrait être pris en compte lors de futurs essais de traitement chez l’homme. Comme la plupart des agents antimicrobiens utilisés pour traiter les infections à Chlamydia affectent seulement les bactéries qui se répliquent, leur potentiel à guérir les infections chroniques peut être modeste.

En conclusion, nos données suggèrent que la télithromycine a le potentiel d’affecter le développement de l’infection chronique à C. pneumoniae dans un modèle de souris et que le traitement par télithromycine peut avoir un effet sur la diminution des changements athérosclérotiques chez ces souris. Ces effets ont été observés uniquement dans les groupes dans lesquels le traitement a été administré après chaque inoculation, mais certaines souris dans ces groupes sont restées positives à l’ADN. Sur la base des résultats actuels et des résultats obtenus avec d’autres modèles animaux, nous émettons l’hypothèse que les traitements antimicrobiens conventionnels ne sont pas efficaces pour éradiquer totalement les chlamydia chroniques et persistantes et que les effets des schémas thérapeutiques plus longs et / ou des combinaisons d’antibiotiques différents être étudié plus avant.

Source et références

Cette étude a été financée par Aventis Pharma, Paris, France.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC521883/

Effet de l’azithromycine plus la rifampicine par rapport à l’amoxicilline seule sur l’éradication et l’inflammation dans l’évolution chronique de la pneumonie à Chlamydia pneumoniae chez la souris.

Les effets du traitement par l’azithromycine et la rifampicine (A + R), l’amoxicilline (A) ou le placebo (P) sur l’évolution chronique de la pneumonie expérimentale à Chlamydia pneumoniae chez la souris ont été évalués par culture, PCR et immunocytochimie. inflammation dans le tissu pulmonaire. L’éradication de l’agent pathogène était significativement plus fréquente et l’inflammation dans les tissus était significativement réduite après traitement par A + R comparé à après traitement par A ou P. Le traitement combiné avec azithromycine et rifampicine a montré des effets favorables dans l’évolution chronique de la pneumonie C. pneumoniae.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10817751

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10348778

Effets de deux régimes antibiotiques sur le cours et la persistance expérimentale de la pneumonie TWAR Chlamydia pneumoniae.

Nous avons étudié les effets de deux régimes antibiotiques sur l’évolution de l’infection à Chlamydia pneumoniae dans les poumons de souris Swiss Webster. Après une provocation intranasale avec des isolats AR-388 (1,3 x 10 (7) unités formant une inclusion par souris) et AR-39 (1,5 x 10 (6) unités formant une inclusion par souris), des groupes d’animaux ont été traités avec de la doxycycline ( 10 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 3 jours), l’azithromycine (10 mg / kg [dose unique]) ou une solution saline. Les réponses ont été évaluées par l’isolement des organismes en culture cellulaire, la détection de l’ADN de TWAR dans les tissus pulmonaires par PCR et l’histologie pulmonaire. Les deux schémas thérapeutiques ont été efficaces pour éliminer les infections induites par l’AR-388 (p = 0,02 et 0,007 pour la doxycycline et l’azithromycine, respectivement) par rapport aux témoins. L’ADN de TWAR a été détecté dans 77 et 25% des poumons négatifs pour la culture deux semaines après le traitement des infections AR-388 et AR-39, respectivement. Les changements histologiques ont montré une pneumonie interstitielle et étaient similaires dans le temps pour tous les groupes. L’azithromycine à dose unique a produit des concentrations de médicament dans les tissus pulmonaires supérieurs aux CMI pour les souches étudiées pendant une période trois fois plus longue que celle de la doxycycline à dose unique. Nous avons conclu que les régimes antibiotiques à court terme ont été couronnés de succès dans le traitement de la pneumonie à TWAR expérimentale chez la souris. L’ADN de TWAR a été fréquemment récupéré des tissus pulmonaires après un traitement apparemment réussi.

Source

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7695327

 

Compléments d’informations sur les antibiotiques et les co infections « Chlamydias, Rickettsia, Bartonnella »

Démonstration intéressante sur la pénétration des antibiotiques en fonction du PH  précise l’utilité de la Rifampicine ou du plaquenil dans une thérapie par antibiotique ou en cas d’antibio résistance à la doxy ou aux macrolides.

http://www.infectiologie.com/UserFiles/File/formation/du/grenoble/dutai-grenoble-2016-17-anti-intracellulaires-cdentan.pdf

 

Chlamydia et Ostéoporose ?

L’infection à Chlamydia pneumoniae entraîne une perte osseuse généralisée chez la souris

L’ostéoporose est associée à une perte osseuse générale. On ne sait pas si les infections pourraient contribuer à l’ostéoporose. Chlamydia pneumoniae provoque des infections chroniques et produit potentiellement des cytokines résorptives osseuses. L’effet de l’infection par C. pneumoniae a été étudié in vivo chez des souris âgées de 10 semaines (c57BL / 6) et in vitro dans la lignée cellulaire humaine ressemblant aux ostéoblastes hFOB 1.19 (hFOB). La densité minérale osseuse (DMO) a été mesurée avant et 16 jours après l’infection. Les souris infectées par C. pneumoniae présentaient une DMO totale et sous-corticale (p <0,05) au niveau du fémur distal et du tibia proximal par rapport aux témoins, mais aucune différence de gain de poids corporel. Les taux d’IL-6 (56 contre 39 pg / mL, p = 0,02) et IL-1beta (11 contre 0 pg / mL, p = 0,003) dans les sérums et les lymphocytes T CD3 (+) étaient plus élevés (p = 0,04). chez les souris infectées par rapport aux contrôles. In vitro, le hFOB infecté par C. pneumoniae était associé à une augmentation de l’expression de l’ARNm de l’IL-6 (p = 0,01) et du RANKL (p <0,05); de plus, la sécrétion d’IL-6 augmentait de manière dose-dépendante (p <0,05). En résumé, les souris infectées par C. pneumoniae présentaient une perte osseuse généralisée associée à une augmentation de l’IL-6 et de l’IL-1. En outre, C. pneumoniae a établi une infection dans une lignée cellulaire d’ostéoblastes in vitro avec des profils de cytokines similaires à ceux in vivo, supportant une liaison causale.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19103778

 

 

 

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Induction de cytokines pro-inflammatoires dans des cellules ostéoblastiques humaines par Chlamydia pneumoniae.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie Gram négatif intracellulaire obligatoire qui provoque une pharyngite récurrente, une pneumonie et une inflammation chronique induite par des cycles de persistance et d’infection productive qui pourraient également expliquer l’association avec des maladies chroniques. Le but de cette étude était de déterminer si C. pneumoniae peut envahir et survivre dans les ostéoblastes humains et si cette infection provoque la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Nos résultats ont démontré que C. pneumoniae était capable d’infecter la lignée cellulaire ostéoblastique SaOS-2 et de se répliquer dans les ostéoblastes d’une manière dépendant du temps et a été associée à une augmentation du nombre de cellules et de la viabilité cellulaire. En outre, l’infection de la lignée cellulaire SaOS-2 avec C. pneumoniae à MOI de 4 est corrélée à une réponse pro-inflammatoire. Les ostéoblastes infectés ont produit des taux accrus de cytokines IL-6, IL-8, IL-17 et IL-23. La production de cytokines a augmenté avec l’interaction ultérieure entre les ostéoblastes et les monocytes et les niveaux maximum de cytokines libérées ont été détectés 72 h après l’infection par C. pneumoniae. Ainsi, le contrôle de la libération de chimiokines, par exemple, IL-23, peut être une stratégie thérapeutique pour prévenir une maladie osseuse inflammatoire et contrecarrer l’inflammation et la destruction osseuse.

 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21803599

Un colloque sur Lyme et ses co-infections a eu lieu au mois de Juin

Cela se passe en ligne aux USA, pour les personnes bilingues cela peut être intéressant d’écouter les conférences de différents spécialistes dont l’approche sera différente mais enrichissante.

The Chronic Lyme Disease Summit 2 , C’est gratuit du 19 au 26 juin 2017,

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J’ai eu le plaisir de suivre la plupart des conférences et en résumé, la tendance, est aux traitements alternatifs  naturels : Klinghart, Scott Forsgren, Wayne Anderson…

Ce qui ressort lors de toutes les interventions

  • L’importance du terrain
  • Soigner les co infections, les levures et les parasites simultanement
  • Détoxifier les métaux lourds
  • Le soutien immunitaire en commençant par soigner l’intestin en priorité
  • La détoxification par tous les moyens
    • Sauna Infra rouge, plantes, charbon, argile, enzyme thérapie…
  • Détox du foie l’importance des molécules type Ornithine, chardon marie, homéopathie
  • Chercher les co-infections et les traiter une par une avec des méthodes naturelles de préférence.
  • L’homéopathie, ostéopathie, acuponcture, biorésonance…
  • Les plantes, type Artemésia, Cat’s Claw, Red Root pour la Lymphe
  • Plantes contre les biofilms. Serrapteptase…
  • L’importance que le patient « s’éduque »…. »nous sommes notre propre guérisseur »  et ne pas oublier que chaque cas est unique. Nous n’avons pas la même tolérance pour tout.
  • Déparasitage, hygiène de vie, bien dormir, bien mangé bio « hygiène +++ » pour aider le métabolisme », pour aider les fonctions mitochondrial , respiration, relaxation….

Cistus incanus, une plante fascinante pleine de ressources pour notre immunité

La composition polyphénolique du thé aux herbes de Cistus incanus et son activité antibactérienne et anti-adhérente contre Streptococcus mutans.

Antiviral, antifongique, bactéricide anti biofilm ? Elle est recommandée par le dr Klinghart.

Riche en polyphénols autant que le renoué du Japon

La plante méditerranéenne Cistus incanus est riche en polyphénols et a montré plusieurs activités pharmacologiques, principalement des effets antibactériens. En outre, des études in situ ont révélé qu’une infusion de C. incanus réduit l’adhérence bactérienne initiale dans la cavité buccale due aux polyphénols, ce qui indique que C. incanus pourrait réduire le risque de maladie de la carie. Dans la présente étude, les polyphénols de quatre différents tisanes commerciales de C. incanus ont été extraits par extraction standardisée des solvants accélérés pour des tests in vitro et par perfusion pour des tests in situ. Les deux extraits ont été caractérisés qualitativement et quantitativement par chromatographie liquide à haute performance et seule la teneur en polyphénols a varié légèrement. Au moyen de la détection de réseau de diodes et de la spectrométrie de masse, 29 polyphénols, y compris les ellagitannines, les flavanols et les flavonols glycosylés, ont été identifiés. De ce fait, seules des différences quantitatives mais non qualitatives entre les quatre échantillons ont été détectées. En outre, l’activité antibactérienne in vitro des extraits de solvant accélérés de C. incanus contre Streptococcus mutans, l’une des principales espèces bactériennes cariogènes, a été examinée à l’aide d’un test vivant / mort (BacLight®). Avec cette approche, C. incanus a donné des propriétés antibactériennes. Des expériences in situ supplémentaires indiquent que les rinçages avec une infusion de C. incanus ont réduit la colonisation bactérienne initiale des échantillons d’émail exposés aux fluides oraux pendant plus de huit heures. En outre, il a été démontré par microscopie électronique à transmission que l’application d’une infusion de C. incanus modifie l’ultrastructure de la pellicule d’émail acquise, ce qui donne une morphologie plus dense aux électrons. On peut supposer que les polyphénols sont responsables des effets observés

Activités antibactériennes et antifongiques des extraits de feuilles de Cistus incanus et C. monspeliensis.

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Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26291656

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10709448

 

La lymphotoxine inhibe la croissance de Chlamydia pneumoniae dans les cellules HEp-2

Les cytokines telles que l’interféron gamma et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) inhibent la réplication intracellulaire de Chlamydia pneumoniae ou de Chlamydia trachomatis. Dans cette étude, nous avons trouvé qu’une autre cytokine, la lymphotoxine (TNF-β), limite la croissance de C. pneumoniae dans les cellules HEp-2. Lorsque la lymphotoxine (10 U / ml) a été ajoutée pendant l’incubation de 8 à 16 h après l’inoculation, la formation du corps d’inclusion a été sévèrement réduite. En outre, nous avons observé l’activation de la production d’oxyde nitrique et la transition nucléaire de NF-κB dans les cellules HEp-2 en réponse à la lymphotoxine. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la croissance de Chlamydia par la lymphotoxine est médiée, au moins en partie, par la transition nucléaire de NF-KB, ce qui entraîne l’induction de l’oxyde nitrique synthase pour produire de l’oxyde nitrique, un puissant agent bactériostatique. Ceci est le premier rapport sur l’activité antichlamydial de la lymphotoxine par induction de l’oxyde nitrique.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie intracellulaire obligatoire qui peut causer des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures chez les humains (15). En outre, l’infection par ce micro-organisme a été associée à des maladies inflammatoires chroniques telles que l’asthme  et l’athérosclérose. Des rapports récents sur l’isolement de C. pneumoniae à partir d’échantillons d’athérome de l’artère coronaire et d’athérome de l’artère carotide  impliquent davantage la bactérie en tant qu’agent causatif de l’athérosclérose.

Il a été démontré que diverses cytokines restreignent la croissance des pathogènes intracellulaires et sont des activateurs significatifs des réponses immunitaires des cellules hôtes aux infections. L’interféron gamma (IFN-γ) a été impliqué dans le contrôle chlamydial chez les humains et les animaux de laboratoire . La base biochimique de l’action antichlamydique de l’IFN-γ peut inclure l’induction d’enzymes intracellulaires comme l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) chez les rongeurs (22, 27) et l’indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO), qui à son tour active la cellule hôte catabolisme du tryptophane chez l’homme . En plus de l’IFN-γ, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est un médiateur de l’inflammation et joue un rôle dans la défense de l’hôte contre l’infection par C. trachomatis. Dans divers types cellulaires, IFN-γ et TNF-α activent iNOS, qui catalyse la conversion de la l-arginine en citrulline et oxyde nitrique (NO), un agent antimicrobien et tumoricide important ainsi qu’une molécule de signalisation cellulaire. Néanmoins, les rapports concernant les rôles relatifs de l’iNOS et d’autres mécanismes d’inhibition de la croissance intracellulaire de Chlamydia par les cytokines ont généralement été catégorisés selon qu’ils impliquaient des systèmes de rongeurs (iNOS) ou des systèmes humains (IDO).

La lymphotoxine (LT), une cytokine sécrétée par les macrophages activés et les lymphocytes , présente une homologie d’environ 30% dans sa séquence d’acides aminés avec le TNF-α. LT et TNF-a sont codés par des gènes étroitement liés qui sont inclus dans le complexe majeur d’histocompatibilité humaine, partagent un récepteur de surface cellulaire commun, p55 , et ont des activités biologiques similaires. Ainsi, LT a également été appelé TNF-β. En outre, TNF-a et LT activent tous deux un facteur de transcription nucléaire, NF-KB, dans des cellules U-937 de type macrophage humain. Dans la présente étude, nous avons testé si LT est également impliqué dans la croissance de C. pneumoniae. Nos résultats montrent que LT a une activité antichlamydial qui peut être médiée par la transition nucléaire de NF-κB, ce qui entraîne l’induction de iNOS. C’est le premier rapport que LT a une activité antichlamydiale et iNOS joue un rôle dans le système antichlamydial chez les humains.

Détermination de la croissance de Chlamydia.

On a laissé les cellules HEp-2 (ATCC CCL 23) adhérer à des plaques de culture tissulaire de 96 puits et on les a cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié d’Iscove (GIBCO) additionné de 5% de sérum de veau foetal et de gentamicine (50 ug / ml) pendant 72 h. utilisation.

C. pneumoniae TW183 (Washington Research Foundation, Seattle) a été passé, titré et stocké à -80 ° C jusqu’à utilisation. La suspension mère de Chlamydia a été diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate, et une aliquote de 0,2 ml (1,5 x 103 unités formant des inclusions [IFU]) a été ajoutée aux monocouches. L’infection a été établie par centrifugation (700 xg) à 22 ° C pendant 1 h, suivie d’une incubation à 36 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2 pendant 1 h. Ensuite, l’inoculum a été aspiré et remplacé par un milieu constitué du milieu de Dulbecco modifié d’Iscove, 10% de sérum de veau fœtal, de cycloheximide (1,5 ug / ml) et de gentamicine (50 ug / ml) (milieu CP). La LT a été purifiée à partir du surnageant de culture de cellules CHO transfectées avec de l’ADN génomique LT humain comme décrit précédemment.

Les cellules HEp-2 infectées cultivées dans du milieu CP ont été incubées avec de la LT pendant une période de 8 h avant ou après l’inoculation. A la fin de chaque période, les cellules ont été lavées une fois avec et placées dans du milieu CP frais préchauffé puis incubées pendant 48 h.

Les monocouches infectées ont été fixées pendant 15 min dans de l’éthanol à 95% et colorées avec un anticorps monoclonal spécifique de C. pneumoniae (dilution RR402: 400 fois, Washington Research Foundation) et des immunoglobulines anti-souris de chèvre marquées à l’isothiocyanate de fluorescéine (dilution 20 fois DAKO, Glostrup, Danemark). Les cellules ont été examinées au microscope à fluorescence à un grossissement de x 100 pour IFU, déterminé sur la base des nombres moyens de corps d’inclusion par champ déterminés à partir de trois champs par puits provenant d’échantillons en triple. Le pourcentage d’inhibition de la croissance de Chlamydia a été calculé [(IFU de contrôle) – (IFU de l’échantillon traité) / (IFU de contrôle)] x 100.

Les valeurs sont exprimées en tant que moyennes ± erreurs types de la moyenne des essais en triple. Les tests t non appariés de Student ont été utilisés pour évaluer la signification statistique des différences. Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

Ffect de LT sur la croissance de Chlamydia.

Des études ont été menées pour déterminer si la LT affecte l’infectiosité et / ou la réplication de C. pneumoniae dans les cellules HEp-2. L’incubation avec LT (10 U / ml) pendant 8 h de 0 à 8 h, 8 à 16 h ou 16 à 24 h après l’inoculation a réduit la croissance de C. pneumoniae à 48 h après l’inoculation de 70, 77 ou 62%, respectivement , alors qu’une faible inhibition a été observée par incubation avec LT pendant 8 h de 24 à 32 h, 32 à 40 h, ou 40 à 48 h après l’inoculation (Fig. La croissance de Chlamydia n’a pas été affectée lorsque les cellules HEp-2 ont été traitées avec LT pendant 8 h ou les micro-organismes chlamydia ont été traités avec LT pendant 1 h juste avant l’inoculation. Une courbe de titrage de LT sur la croissance de Chlamydia a révélé que LT à des concentrations supérieures à 10 U par ml inhibait la croissance (figure 1B) .1B). Puisque le l-tryptophane est connu pour sauver C. pneumoniae de l’effet bactériostatique de l’IFN-γ (38), nous avons testé si le tryptophane exogène réduisait l’inhibition de la croissance de Chlamydia induite par LT. Lorsque des cellules infectées par C. pneumoniae ont été incubées avec LT en l’absence ou en présence de diverses concentrations de l-tryptophane, la croissance de Chlamydia a été réduite de la même manière.

L’inhibition de l’IFU dans les transfectants était d’environ 80% à 36 h après l’inoculation (Fig. 2B), proche de celle des cellules HEp-2 incubées avec 10 U de LT par ml (Fig. .1B) .1B). Ces résultats suggèrent que la LT extracellulaire produite par les transfectants inhibe la croissance de Chlamydia, bien qu’il reste possible que la LT intracellulaire inhibe directement la croissance. Dans une expérience séparée, nous avons déterminé LT par un test de lyse de cellule L-M (ATCC CCL 1.2) . Les transfectants BHK-175 et BHK-110 produisent LT dans les surnageants de culture de 24 h à des niveaux de 64 à 128 et de 32 à 64 U par ml, respectivement, tandis que les cellules BHK-21 et HEp-2 non transfectées ne produisent pas de niveaux détectables de LT. . Ainsi, l’inhibition de la croissance de Chlamydia dans les cellules productrices de LT semble être inférieure à celle attendue des niveaux de LT produits, probablement en raison de la différence de réponse à la LT entre les cellules BHK et les cellules HEp-2. Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que les cellules sensibles à la chlamydia pourraient être transformées en cellules à faible susceptibilité en introduisant le gène LT.

Rôle du NO dans l’activité antichlamydiale de LT.

Puisque les cytokines antichlamydiales comme le TNF-α et l’IFN-γ induisent l’iNOS, nous avons testé si LT induisait aussi iNOS dans les cellules infectées. Les cellules HEp-2 ont été traitées par LT en présence d’acétate de N-guanidino-monométhyl-l-arginine (MLA, WAKO, Osaka, Japon), un inhibiteur spécifique de la NO synthase (24). Le cycloheximide a été omis du milieu lorsque le MLA a été ajouté. Les cellules ont été cultivées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits, infectées avec 1,5 x 103 IFU de C. pneumoniae par puits, et incubées à 36 ° C pendant 48 h. La production de NO a été évaluée en déterminant les concentrations de nitrite dans le surnageant de culture en utilisant le réactif de Griess comme décrit précédemment.

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Les niveaux de nitrite dans les surnageants des cellules HEp-2 non infectées ou infectées par C. pneumoniae ont augmenté de trois à cinq fois lorsque la LT a été ajoutée (figure 3A) .3A). Lorsque l’inhibiteur de la NO synthase MLA a été ajouté avec LT, les niveaux de nitrite ont été réduits à moins de 20%. Conformément à ces observations, la croissance de chlamydia inhibée par LT a été sauvée de manière significative en ajoutant du MLA (figure 3B) .3B). Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que LT présente une activité antichlamydiale, au moins en partie, en induisant une synthèse de NO. Ces résultats ont fourni des preuves initiales que l’iNOS joue un rôle dans le système antichlamydial chez l’homme.

Transition nucléaire de NF-κB dans des cellules HEp-2 traitées par LT.

Puisque l’induction de iNOS dépend de NF-κB activé pour le transport vers le noyau  nous avons déterminé l’effet de LT sur la transition nucléaire de NF-κB par une méthode indirecte avec un anticorps anti-NF-κB de lapin ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) et immunoglobuline anti-lapin de chèvre marquée à la fluorescéine. Lors d’un examen au microscope à fluorescence, les cellules HEp-2 traitées pendant 15 min avec LT à des concentrations de 7,25 à 116 U par ml ont montré une transition nucléaire significative de NF-κB, alors que les cellules traitées avec LT à des concentrations inférieures à 3,63 U par ml la transition nucléaire même après une incubation prolongée (données non présentées). Ces résultats suggèrent que le traitement par LT active NF-KB, qui à son tour peut activer iNOS.

Dans cette étude, nous avons montré que le traitement par LT des cellules HEp-2 infectées par C. pneumoniae réduisait nettement la formation de corps d’inclusion. L’inhibition la plus élevée a été observée lorsque la LT était présente pendant 8 h entre 8 et 16 h après l’inoculation (figure 1A), ce qui peut correspondre à la période de réplication de Chlamydia (5).

Des études antérieures ont démontré que l’IFN-γ ou le TNF-α réduit l’infectiosité chlamydiale in vitro. Cependant, il n’y a pas eu de rapport sur l’effet de la LT (TNF-β) sur l’infectivité à Chlamydia. De nombreuses cellules de mammifères montrent une sensibilité à LT ou expriment les récepteurs de LT (ou TNF). Les cellules BHK-21 expriment également le récepteur de LT , et les cellules HEp-2 réagissent à LT dans cette étude. LT ainsi que TNF-α et IFN-γ sont des activateurs puissants de NF-κB, un amplificateur transcriptionnel ainsi qu’un composant critique dans les voies de transduction du signal conduisant à l’induction de iNOS. Nous avons montré pour la première fois que LT induit efficacement iNOS in vitro dans des cellules HEp-2 soit sans ou avec une infection par C. pneumoniae (figure 3A) .3A). Puisque l’activité antichlamydiale de la LT a été partiellement supprimée par l’ajout de MLA, un inhibiteur de NO synthase (Fig. 3B), le NO semble jouer un rôle dans l’activité antichlamydiale. En outre, LT a induit la transition nucléaire de NF-κB dans les cellules HEp-2, suggérant que l’induction médiée par NF-κB de iNOS (42) est impliquée dans l’activité antichlamydiale.

Lorsque les cellules HEp-2 ont été traitées avec LT pendant 8 h juste avant l’inoculation de C. pneumoniae, l’infectiosité n’a pas été affectée (Fig. 1A), suggérant que la production de NO amorcée par le LT, même après l’élimination de LT, n’était pas suffisante pour supprimer l’infection. L’effet antichlamydial marqué de LT ajouté à la première période de 8 h peut être dû à l’inhibition de la phagocytose induite des corps élémentaires, à leur transformation en corps réticulés et / ou à l’initiation de la replication des corps réticulés. Cependant, il existe plusieurs explications tout aussi plausibles des effets antichlamydiens du NO, y compris l’inhibition de la réplication de l’ADN chlamydial et l’inhibition de la respiration des cellules hôtes .

Le tryptophane est un acide aminé essentiel pour les chlamydiae, et il a été suggéré que son pool intracellulaire diminue à la suite de la dégradation enzymatique par l’IDO induite par l’IFN-γ, entraînant une restriction de la croissance chlamydiale à un état persistant (3, 4). L’activité antichlamydiale de l’IFN-γ seul ou du TNF-α peut être supprimée par l’addition de tryptophane. En revanche, l’élévation des concentrations de tryptophane dans le milieu n’a pas affecté l’anti-C. activité pneumoniae de LT, comme indiqué dans cette étude. Par conséquent, nous avons conclu que l’induction d’IDO peut ne pas être une cause majeure de l’activité antichlamydial de LT observée dans cette étude.

Il convient de noter que l’addition de MLA n’a pas entraîné un blocage complet de l’activité antichlamydiale de LT  suggérant que l’induction de iNOS pourrait ne pas être le seul mécanisme d’inhibition de la croissance de Chlamydia. par LT. Des études récentes sur des souris knock-out iNOS ont indiqué que iNOS est dispensable pour l’élimination de C. trachomatis de l’épithélium génital. Il a été montré que le TNF-α induisait de faibles quantités d’ARNm pour l’IFN-β, un agent antiviral, dans les cellules HEp-2 . Nous avons évalué l’anti-C. l’activité pneumoniae d’autres cytokines, y compris l’IFN-a, l’IFN-ß, et le facteur stimulant les colonies de granulocytes, et ont trouvé que ces cytokines ne parvenaient pas à supprimer la croissance intracellulaire des chlamydiae (données non présentées). LT et TNF-a partagent une sous-unité de récepteur de surface commune, p55, mais le TNF-a nécessite en plus la sous-unité p75 pour sa liaison. Il est possible que ces cytokines exercent des effets antichlamydiens via différents mécanismes.

D’autres études sur la fonction de LT et le devenir intracellulaire de C. pneumoniae peuvent éclairer le mécanisme de l’infection persistante et conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques vers le traitement de l’athérosclérose médiée par l’infection à C. pneumoniae.

 

Sources

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC96642/

Cette étude a été financée par une subvention au titre de la recherche scientifique du Ministère de l’éducation, de la science, de la culture et des sports du Japon  et par une subvention de la Société japonaise pour la promotion des sciences