Chlorella une aide précieuse en soutien grâce aux propriétés anti LPS

Effets bénéfiques du peptide Chlorella-11 sur le blocage de l’activation des macrophages induite par le LPS et l’atténuation de l’inflammation induite par les blessures thermiques chez les rats.

 

On sait que lorsque l’on traite les bactéries à chlamydia, les bactéries relâchent des endotoxines LPS qui a un effet pire que la bactérie en elle même sur le court terme et provoque de l’inflammation souvent insupportable lors des traitement.

La Chlorella possède diverses activités biologiques remarquables. Un composant, le Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe (peptide Chlorella-11) s’est avéré capable de supprimer la production de NO induite par le LPS et l’inflammation.

Cherng JY1, Liu CC, Shen CR, Lin HH, Shih MF.
Informations sur l’auteur

Cependant, le mécanisme moléculaire derrière ces résultats et la cohérence entre les données in vitro et in vivo n’ont pas été étudiés. Les macrophages RAW 264.7 activés par les LPS ont été utilisés pour étudier les effets anti-inflammatoires moléculaires in vitro du peptide Chlorella-11.

Après activation, la production de NO et l’expression des protéines iNOS et NF-kappaB ainsi que de l’ARNm iNOS ont été mesurées en utilisant le dosage colorimétrique Griess, le transfert Western et la RT-PCR, respectivement. Les altérations des teneurs en PGE2 et en TNF-alpha ont également été contrôlées par ELISA. Pour des études in vivo, on a utilisé des rats Wistar à lésion thermique et des indications inflammatoires, par ex. la malondialdéhyde sérique (MDA), les niveaux de TNF-alpha et l’érythème cutané ont été évalués 48 h après la mise en place de la lésion. Les résultats in vitro ont montré que le peptide Chlorella-11 produisait une inhibition dépendante de la dose et du temps de la production de NO. L’inhibition efficace peut persister pendant au moins 6 heures après l’activation du LPS. Il a également été trouvé que l’expression de l’ARNm d’iNOS induite par le LPS, des protéines iNOS et NF-kappaB était diminuée par le traitement peptidique. Parallèlement, les niveaux de production de TNF-alpha et de PGE2 après l’activation du LPS ont également été inhibés. Ces résultats sont en accord avec les données in vivo selon lesquelles les taux sériques de MDA et de TNF alpha chez les animaux et l’érythème cutané chez les rats étaient considérablement réduits par rapport au groupe témoin (traité par solution saline). L’importance de cette étude met en lumière l’efficacité du peptide Chlorella-11 dans la prévention de la progression de l’inflammation in vitro et in vivo et son potentiel pour des applications cliniques.

 

Chlorella 11-peptide inhibe la production de molécules d’adhésion induites par les macrophages et réduit l’expression de l’endothéline-1 et la perméabilité endothéliale

Abstrait

Le processus inflammatoire dans les gros vaisseaux implique la régulation des molécules d’adhésion vasculaire telles que la sélectine des cellules endothéliales (E-sélectine), la molécule d’adhésion cellulaire intercellulaire-1 (ICAM-1) et la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire-1 (VCAM-1). sont également connus comme les marqueurs de l’athérosclérose. Nous avons rapporté que le peptide 11 de Chlorella présentait des effets anti-inflammatoires efficaces. Ce peptide avec une séquence amino Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe a été davantage examiné pour son potentiel dans la prévention de l’athérosclérose dans cette étude. En particulier, les rôles du Chlorella 11-peptide dans l’abaissement de la production de molécules d’adhésion vasculaire, la protéine monocytaire chimioattractive (MCP-1) et l’expression de l’endothéline-1 (ET-1) des endothéliums (cellules SVEC4-10) ont été étudiés. La production de E-sélectine, ICAM-1, VCAM-1 et MCP-1 dans des cellules SVEC4-10 a été mesurée avec ELISA. L’expression de l’ARNm de ET-1 a été analysée par RT-PCR et gel d’agarose. Les résultats ont montré que Chlorella 11-peptide supprime de manière significative les niveaux de E-sélectine, ICAM, VCAM, MCP-1 ainsi que l’expression du gène ET-1. L’inhibition de la production de ICAM-1 et de VCAM-1 par le Chlorella 11-peptide a été inversée en présence d’inhibiteur de protéine kinase A (H89), ce qui suggère que la voie de l’AMPc était impliquée dans la cause inhibitrice du peptide. En outre, il a été montré que ce peptide réduit l’étendue de la perméabilité intercellulaire accrue induite par la combinaison de 50% de milieu de cellules RAW 264.7 activé par lipopolysaccharide (LPS) et 50% de milieu de culture cellulaire SEVC normal (appelé milieu conditionné à 50% de RAW). ). Ces données démontrent que Chlorella 11-peptide est une biomolécule prometteuse dans la prévention des maladies vasculaires inflammatoires chroniques.

1. Introduction

Les molécules d’adhésion circulantes (CAM) sont des protéines exprimées par l’endothélium vasculaire qui sont supposées jouer un rôle dans l’initiation du processus athérosclérotique. Il existe plusieurs familles de CAM, y compris les intégrines, les cadhérines, les sélectines et les membres de la superfamille des immunoglobulines [1]. Cependant, les molécules d’adhésion les plus importantes impliquées dans l’athérosclérose semblent être la molécule d’adhésion cellulaire intercellulaire-1 (ICAM-1), la sélectine des cellules endothéliales (E-sélectine) et la molécule d’adhésion des cellules vasculaires-1 (VCAM-1). Un taux élevé de ICAM-1 a montré une corrélation avec un risque accru d’événements cardiovasculaires [2]. Les niveaux d’E-sélectine sont en corrélation avec le risque de maladie cardiovasculaire (CVD) [3] et ont été utilisés avec succès pour prédire la sévérité de l’athérosclérose chez les patients [4]. VCAM-1 est un marqueur spécifique de l’athérosclérose avancée, car il est souvent exprimé dans les plaques d’athérosclérose [5]. Un niveau élevé de VCAM-1 est généralement associé à un risque accru d’événements coronariens chez les personnes atteintes de MCV existantes [2]. Des études indiquent également que la réduction du taux circulant de ces molécules d’adhésion pourrait réduire le risque de MCV [6]. La régulation positive des molécules d’adhésion sur les cellules endothéliales est importante après l’exposition de ces cellules à des molécules pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF) -α, l’interleukine (IL) -8 et la protéine chimioattractive monocytaire-1 (MCP-1). ) [7]. Initié par MCP-1, le recrutement et l’activation des monocytes / macrophages sont suivis et contribuent à l’initiation et la physiopathologie de la cardiopathie ischémique [8,9]. De plus, le MCP-1 serait impliqué dans le développement de l’athérosclérose [10], de la coronaropathie [11], du remodelage myocardique post-ischémique [12] et de l’insuffisance cardiaque [13]. La recherche sur la thérapie génique anti-MCP-1 a réussi à atténuer l’athérosclérose chez des souris déficientes en ApoE [14], ce qui suggère que la MCP-1 est une cible thérapeutique potentielle dans l’athérosclérose.

De plus, l’endothéline-1 (ET-1) sécrétée par les cellules endothéliales vasculaires agit comme un puissant vasoconstricteur endogène et joue un rôle important dans l’étiologie de la maladie vasculaire athéroscléreuse [15]. Lorsque les endothéliums sont sous inflammation, leur perméabilité intercellulaire accrue permettrait également l’absorption du cholestérol dans la paroi vasculaire [15]. Par conséquent, il a été démontré que la réduction de l’expression ET-1 élevée et de la perméabilité intercellulaire endothéliale restante à la normale constitue une approche efficace pour bloquer le développement de troubles circulatoires, y compris l’hypertension et l’athérosclérose [16].

Les algues vertes sont capables de prévenir l’hyperlipidémie induite par un régime riche en graisses [17] et l’athérosclérose chez les animaux de laboratoire [18]. De plus, Chlorella 11-peptide dérivé de l’algue verte démontre divers effets biologiques. Les composants du peptide 11 de Chlorella sont (Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe). Il a récemment été montré qu’il diminuait l’expression de l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et l’activité du facteur nucléaire-kappa-B (NF-κB) et possédait des propriétés antioxydantes [19,20]. Puisque l’athérosclérose est connue pour être associée à un cholestérol élevé et à une inflammation chronique [21], l’examen des relations entre les molécules d’adhésion, MCP-1, ET-1, l’intégrité de la membrane endothéliale avec Chlorella 11-peptide aiderait à explorer leur potentiel thérapeutique. athérosclérose. Dans cette étude, le surnageant de culture RAW264.7 stimulée par LPS a été ajouté aux cellules endothéliales (SVEC4-10) pour la stimulation de ces cellules. En effet, l’activation des macrophages produit des cytokines pro-inflammatoires nécessaires au développement de l’athérosclérose [22]. Après les stimuli de SVEC4-10, les réponses des endothéliums avec et sans Chlorella 11-peptide ont ensuite été évaluées.

2. Résultats et discussion

2.1. Effets Inhibiteurs Du Chlorella 11-Peptide Sur La Production De MCP-1 Induite Par Le LPS Dans Les Macrophages RAW264.7

La différence de production de MCP-1 entre les groupes traités par LPS et les groupes de base a atteint un maximum à 12 h après la stimulation par le LPS [23].

Par conséquent, ce point de temps a été choisi pour une étude plus approfondie (p <0,005, figure 1). La production de MCP-1 induite par le LPS était significativement inhibée (p <0,005 et p <0,05) par le Chlorella 11-peptide (38 μM et 9 μM, respectivement). L’indométhacine, un anti-inflammatoire non stéroïdien, a également montré une inhibition de la production de MCP-1 induite par le LPS. L’effet inhibiteur de l’indométhacine (0,25 mM) sur la production de MCP-1 s’est avéré similaire à celui de Chlorella 11-peptide dans une faible dose (9 μM) mais moins puissant que dans une forte dose (38 μM) de Chlorella 11 -peptide.

Des études ont montré que le LPS induit la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1, IL-6) qui contribuent à l’inflammation vasculaire et à l’athérosclérose [19] et l’apparition de l’athérosclérose par adhérence des monocytes aux cellules endothéliales activées [21]. Dans la présente étude, nous avons constaté que LPS induit significativement la production de MCP-1 dans les macrophages à 12 h (Figure 1). Par conséquent, le surnageant de cellules de macrophages stimulées par LPS cultivées à 12 h a été appliqué pour induire des molécules d’adhésion dans les cellules endothéliales SVEC4-10 et ces molécules induites par rapport au peptide 11 de Chlorella peuvent ensuite être évaluées.
2.2. Effets Inhibiteurs De Chlorella 11-Peptide Sur E-sélectine, ICAM-1 Et VCAM-1 Production Induite Par 50% RAW-Conditionné Moyen

La MCP-1 recombinée et d’autres cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et IL-6 recombinés), comme mentionné dans l’introduction du manuscrit, sont capables d’induire des molécules d’adhésion. Ces preuves ont toutes été bien démontrées par le travail des autres et ont été testées dans nos expériences préliminaires (données non montrées). De plus, dans nos expériences, nous avons également trouvé que le milieu RAW traité au Chlorella 11-peptide n’était pas capable d’induire la production de molécules d’adhésion comme témoin (données non montrées). La production d’E-sélectine dans les cellules endothéliales SVEC4-10 a été significativement induite par un milieu conditionné RAW à 50% (p <0,005, Figure 2). Les concentrations élevées (38 μM) et faibles (9 μM) de Chlorella 11-peptide ont été capables de diminuer significativement la production d’E-sélectine (p <0,005 et p <0,01, respectivement). Cependant, l’indométhacine n’a pas affecté la production de E-sélectine induite par 50% de milieu conditionné RAW. Il y avait environ une augmentation de 5 fois dans la production de ICAM-1 lorsque les cellules endothéliales SVEC4-10 ont été stimulées avec 50% de milieu conditionné RAW (figure 3). La production accrue d’ICAM-1 était significativement inhibée par le Chlorella 11-peptide et l’indométhacine (p <0,005, Figure 3). VCAM-1 production a également été induite avec 50% de milieu conditionné RAW (figure 4). Notamment, ni la faible concentration de 11-peptide de Chlorella ni l’indométhacine ne présentaient d’inhibition sur l’induction de VCAM-1. Cependant, la forte concentration de Chlorella 11-peptide a significativement supprimé la production de VCAM-1 (p <0,005).

 

 

 

Normalement, l’E-sélectine exprimée par les cellules endothéliales est faible, mais les cytokines, les espèces réactives de l’oxygène et l’endotoxine bactérienne peuvent provoquer son expression [24]. ICAM-1 est exprimée constitutivement sur les cellules endothéliales dans la plupart des lits vasculaires régionaux, et son expression peut être significativement augmentée avec des cytokines ou des endotoxines bactériennes. En comparaison avec ICAM-1, VCAM-1 médie principalement l’adhésion des lymphocytes et des monocytes lors de la stimulation [25]. Amberger et al. ont rapporté une faible expression du gène VCAM-1 des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine après stimulation par le TNF-α [26]. Il est important de noter que toutes ces molécules d’adhésion élevées en relation positive avec l’athérosclérose ont été substantiellement réduites par la présence du peptide 11 de Chlorella (38 uM). L’indométhacine est un puissant agent anti-inflammatoire. Cependant, ses effets inhibiteurs sur les molécules d’adhérence induites par les cytokines pro-inflammatoires (par exemple E-sélectine, VCAM-1) n’étaient pas aussi efficaces que ceux illustrés à la Figure 2 et Figure 4. De plus, comparé à l’indométhacine (Figure 4) peut efficacement soulager à la fois la production de ICAM-1 et VCAM-1 qui sont responsables de la transmigration des leucocytes (ICAM-1) et la transduction du signal leucocyte-endothélium (VCAM-1) [27,28].

L’AMP cyclique est un régulateur omniprésent des réactions inflammatoires et immunitaires. La médiation de la communication croisée de cellules par l’intermédiaire de molécules d’adhésion (par exemple, ICAM-1, E-sélectine, VCAM-1) a été rapportée comme étant dépendante de l’AMPc intracellulaire [29, 30, 31]. Dans cette étude, nous avons utilisé un inhibiteur de la protéine kinase A, H89 [26], pour étudier si les effets inhibiteurs de Chlorella 11-peptide sur la production de ICAM-1 et VCAM-1 ont été médiés via la voie de l’AMPc. Nous avons montré que l’addition de H89 peut compromettre les effets inhibiteurs de Chlorella 11-pepetide sur la production de ICAM-1 et VCAM-1 induite (Figure 3 and Figure 4). Cela indique que la voie de l’AMPc était probablement impliquée dans les actions inhibitrices du peptide. La réaction de H89 à l’indométhacine sur la production de VCAM-1 induite n’a pas été observée (figure 4). L’explication possible est que l’indométhacine nécessite une concentration beaucoup plus élevée (supérieure à 20 mM) pour inhiber l’activité de la protéine kinase AMPc dépendante [32], ce qui est beaucoup plus élevé que la concentration (0,25 mM) utilisée dans cette étude.
2.3. Effets Inhibiteurs De Chlorella 11-Peptide Sur L’expression Génique De L’endothéline-1

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L’addition de 50% de milieu conditionné par RAW a fortement induit l’expression de l’ARNm de l’endothéline-1 (ET-1) dans les cellules endothéliales SVEC4-10 (p <0,005, figure 5). Cette induction de l’expression du gène ET-1 peut être significativement inhibée par la forte dose de Chlorella 11-peptide (p <0,005) et d’indométhacine (p <0,01).

L’expression de l’ARNm de l’ET-1 était élevée dans l’artère avec une lésion athéroscléreuse [16]. L’antagonisme des récepteurs ET-1 a permis de réduire la formation de lésions athéroscléreuses [33]. Ainsi, le blocage de l’ET-1 a été considéré comme une stratégie de prévention de l’athérosclérose [15]. Dans cette étude, les données ont montré que Chlorella 11-peptide est capable de supprimer de manière significative l’expression de l’ARNm ET-1 et détient un grand potentiel dans les utilisations anti-athérosclérose.
2.4. Effets Inhibiteurs De Chlorella 11-Peptide Sur La Perméabilité Intercellulaire De L’endothélium

Après des stimuli de 50% de milieu conditionné RAW, la perméabilité intercellulaire endothéliale SVEC4-10 a montré une forte augmentation (p <0,005, figure 6). Les doses élevées et faibles de Chlorella 11-peptide ont inhibé l’augmentation de la perméabilité intercellulaire (p <0,005). De plus, cette inhibition de la perméabilité intercellulaire n’a pas été observée dans le groupe traité par l’indométhacine.

 

La perméabilité endothéliale est contrôlée en partie par l’ouverture et la fermeture dynamiques des jonctions cellule-cellules endothéliales qui se rapportent aux interactions entre les cellules endothéliales et la matrice extracellulaire [34,35]. L’augmentation de la perméabilité endothéliale aux lipoprotéines ou aux cellules immunitaires est considérée comme une étape initiatrice de la pathogenèse de l’athérosclérose, et l’accumulation de débris dans l’intima conduirait à des plaques athérosclérotiques [21]. Par conséquent, le maintien de la perméabilité endothéliale non affectée par les cellules pro-inflammatoires aiderait à diminuer la formation de plaque [36]. Notre test de perméabilité a montré que Chlorella 11-peptide possède une puissante capacité à inhiber la perméabilité intercellulaire accrue de l’endothélium SVEC4-10 induite par 50% de milieu conditionné RAW (Figure 6), ce qui indique l’efficacité du peptide dans la prévention du développement de l’athérosclérose .
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3. Section expérimentale
3.1. Matériaux

Le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM), le pyruvate de sodium et l’acide aminé non essentiel ont été achetés chez Gibco BRL (Taipei, Taiwan). L’indométhacine (I17378), la papaïne, la pepsine, le réactif de Bradford (B6919) et H89 ont été achetés auprès de Sigma (Taipei, Taiwan). Le flavourzyme de type A et l’alcalase ont été achetés auprès de Novo Nordisk (Taipei, Taiwan). Un système de miniprep à ARN total (Viogene BioTek Corporation, Taipei, Taiwan) et Access RT-PCR (Promega, Madison, WI, USA) ont été utilisés pour la RT-PCR. Les kits d’analyse ELISA MCP-1, VCAM, ICAM et E-selectine étaient des produits de systèmes de R & D (Taipei, Taiwan). Tous les produits chimiques ont été dissous dans de l’eau déminéralisée stérilisée à l’exception de l’indométhacine dans de l’éthanol aqueux à 95% et de la pepsine dans du HCl 10 mM froid (4 mg ml « 1).

3.2. Chlorella-11 Préparation du peptide

Le peptide Chlorella-11 de Chlorella pyrenoidosa a été préparé à partir de déchets de protéines algales essentiellement comme décrit précédemment [19,20]. Les déchets de protéines algales ont été obtenus à partir du matériau insoluble après extraction à l’eau chaude de Chlorella pyrenoidosa. Ensuite, les déchets de protéines algales (10%, p / v) ont été digérés avec des protéases commerciales (pepsine, flavourzyme, alcalase et papaïne) à la concentration de 0,2% (p / v) pendant 15 h au pH et à la température indiqués pour chaque réaction enzymatique, en utilisant les conditions de réaction fournies par le fabricant. A la fin de la réaction, la digestion a été chauffée dans un bain d’eau bouillante pendant 10 minutes afin d’inactiver l’enzyme. Le matériau non soluble résultant a ensuite été séché par pulvérisation et a été extrait avec du methanol (1:10 p / v) pendant trois fois. Après avoir été concentrée, la fraction extraite au MeOH a été ensuite extraite à nouveau avec de l’eau distillée avant la lyophilisation.

L’isolement et la purification du Chlorella 11-peptide étaient tels que décrits précédemment avec modification [19,20]. Brièvement, du sulfate d’ammonium a été ajouté pour précipiter les protéines et les protéines précipitées ont été éliminées par centrifugation (10 000 x g, 30 min) et dissoutes dans un petit volume d’eau distillée. La solution a été fractionnée en utilisant une colonne HR de Sephacryl S-100 (φ 2,6 x 70 cm) pour détecter les peptides à 210 nm. La fraction a été recueillie et ensuite chargée sur une colonne Q-Sepharose Fast Flow (φ 2,6 x 40 cm), qui a été pré-équilibrée avec une solution tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,8). La séparation a été effectuée avec du NaCl 1,0 M dans la même solution tampon et les fractions ont été recueillies, dialysées dans de l’eau désionisée et lyophilisées. La concentration en peptide a été déterminée avec un dosage de protéines Pierce micro BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Le poids moléculaire des peptides a été déterminé en utilisant une colonne Superdex peptide HR 10/30 à un débit de 0,5 ml / min. La courbe standard a été établie avec le cytochrome c (MW 12327 Da), l’approtonine (MW 6500 Da), la gastrine (MW 2098 Da) et Leu-Gly (MW 188 Da).

La fraction peptidique a été en outre séparée successivement par une colonne HPLC en phase inverse, et un peptide purifié a été atteint. La pureté et l’identité de la préparation finale ont été confirmées par analyse spectrométrique de masse sur spectromètre de masse Q-TOF Agilent 6510 (> 95%) et dégradation d’Edman (voir Informations supplémentaires). La séquence de 11-peptide de Chlorella a été déterminée comme Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe, avec une masse moléculaire de 1309 Da. Dans les dernières parties de notre travail, nous avons utilisé le peptide synthétique fourni par Kelowna International Scientific Inc. (Taiwan).
3.3. RAW264.7 Culture de macrophages

Les macrophages RAW264.7 (numéro ATCC: TIB-71) ont été obtenus auprès de Bioresource Collection & Research Centre (Taiwan) et cultivés dans du DMEM additionné de 10% de sérum fœtal bovin (Hyclone), 2 mM de glutamine, 1% d’acide aminé non essentiel. , 25 mM d’HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Les cellules ont été cultivées et maintenues dans des flacons de 75 T (1 x 107 cellules / boîte) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02.

3.4. MCP-1 Assay

Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées à une densité de 2 x 104 cellules / puits dans des plaques à 96 puits. Ensuite, les cellules ont été incubées en présence de LPS (1 ug / ml) avec / sans peptide 11 de Chlorella (9 uM et 38 uM) pendant 12 heures avant de recueillir le milieu de culture pour la mesure de MCP-1. Ce surnageant de culture (sans traitement peptidique) a également été prélevé pour préparer un « milieu RAW-conditionné à 50% » (voir la section suivante). La gamme de concentration de Chlorella 11-peptide a été choisie sur la base de notre découverte précédente [19]. L’indométhacine (0,25 mM) a été utilisée comme témoin positif. Les niveaux de MCP-1 dans les milieux de culture ont été déterminés avec des kits de dosage ELISA commerciaux.
3.5. Molécules d’adhésion – E-sélectine, mesures de niveau ICAM-1 et VCAM-1 dans les cellules endothéliales SVEC4-10

Les cellules SVEC4-10 (numéro ATCC: CRL-2181), qui sont bien différenciées, réagissent comme les cellules endothéliales normales à certaines interleukines et aux signaux de la matrice extracellulaire pour la différenciation en tube. Il a été démontré que la SVEC4-10 conservait les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles de la CE normale [37]. Les cellules endothéliales SVEC4-10 ont été obtenues auprès de Bioresource Collection & Research Center (Taiwan) et cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum fœtal bovin, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U / ml de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine. . Les cellules ont été maintenues dans des boîtes de Pétri de 100 mm à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02. Les cellules SVEC4-10 ont été ensemencées à une densité de 2 x 104 cellules / puits dans des plaques à 96 puits pendant une nuit avant les traitements. Pour les stimuli, le milieu de culture des cellules SVEC4-10 a été changé en « milieu RAW-conditionné à 50% » (à volume égal de milieu SVEC4-10 et surnageant de milieu de culture RAW264.7 stimulé par LPS) avec et sans Chlorella. -peptide. L’indométhacine a été dissoute dans de l’éthanol à 95% et appliquée en tant que contrôle positif et les cellules ont été incubées pendant 24 h supplémentaires avant les dosages E-sélectine et ICAM-1 et 6 heures avant le dosage VCAM-1. La concentration de ces molécules d’adhésion a été mesurée avec des kits de dosage ELISA du commerce.
3.6. Analyse de l’ARNm de l’endothéline-1 par transcription inverse – réaction en chaîne de la polymérase (RT-PCR)

Les cellules endothéliales SVEC4-10 (2 x 105 cellules / ml) dans une boîte de 100 mm ont été stimulées avec un milieu conditionné à 50% de RAW en présence de Chlorella 11-peptide et incubées pendant 24 h. L’ARN total a été extrait en utilisant un kit d’isolement d’ARN GENTRA (R-5000A, Minneapolis, MN, USA). L’ARN a été soumis à une transcription inverse en utilisant un kit de synthèse d’ADNc de premier brin pour la RT-PCR (système Access RT-PCR, Promega, Madison, WI, USA). Une PCR semi-quantitative a été réalisée en utilisant des amorces pour l’ET-1 de souris (forward, 5′-AAGCGCTGTTCCTGTTCTTCA-3 ‘, reverse, 5′-CTTGATGCTATTGCTGATGG-3′) et le gène d’entretien β-actine (forward, 5’-GTGGGCCGCTCAGGCCA-3 ‘ ; inverse, 5’-CTCAGCTGTGGTGGTGAAGC-3 ‘). Les produits de réaction ont été examinés par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1% et visualisés avec du bromure d’éthidium. L’analyse densitométrique a été réalisée en utilisant le système de documentation et d’analyse Alpha Imager 2000 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA).

3.7. BSA Transwell Permeability Assay

Les cellules SVEC4-10 ont été ensemencées (1 x 105 cellules / insert) sur des filtres en polystyrène enrobés de gélatine (1%) (Costar Transwell, taille des pores = 0,4 mm, Corning Inc., Taiwan), laissés à confluence sur des inserts Transwell et puis remplacé par du milieu sans FBS pendant 3 h supplémentaires [38]. Un milieu exempt de FBS contenant 10 mg / ml de BSA a été placé dans le compartiment supérieur et un milieu exempt de FBS sans BSA a été placé dans le compartiment inférieur du Transwell. La vitesse de transfert à travers la monocouche cellulaire a été évaluée en mesurant la quantité accrue de BSA dans le compartiment inférieur après 30 min. La BSA a été quantifiée en utilisant le réactif de Bradford.
3.8. Analyses statistiques

Les données des résultats (n ≥ 8) de différents jours expérimentaux ont été analysées statistiquement pour MCP-1, E-sélectine, ICAM-1, VCAM-1 et les tests de perméabilité intercellulaire en utilisant le logiciel Prism (GraphPAD Inc., La Jolla, CA, USA). ). Un test non apparié de Student à deux queues a été appliqué pour comparer les valeurs moyennes de deux populations de données continues. La distribution normale et la variance de chaque groupe étaient les mêmes. Des données de gel d’électrophorèse ont été réalisées (n ≥ 3) et un exemple représentatif est montré dans les résultats.
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4. Conclusions

L’expression de diverses CAMs par des cellules endothéliales activées est une étape déterminante de la vitesse dans le recrutement des cellules inflammatoires et joue un rôle central dans la progression de CVD [6, 24]. Notre étude précédente a clairement montré que les peptides de Chlorella sont un inhibiteur très efficace de la production de TNF-α et d’IL-6 dans les macrophages [19]. Dans cette étude, nous démontrons en outre que Chlorella 11-peptide pourrait non seulement empêcher la production de MCP-1 induite par le LPS dans les macrophages RAW264.7, mais aussi inhiber efficacement la production de molécules d’adhésion dans les cellules endothéliales. De plus, ce peptide s’est montré capable de soulager l’expression de l’ARNm de l’ET-1 et de maintenir la perméabilité endothéliale non affectée sous l’influence des cytokines pro-inflammatoires. En combinant ces résultats, Chlorella 11-peptide peut devenir une biomolécule potentielle dans l’amélioration du développement de l’athérosclérose.
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Remerciements

Nous sommes très reconnaissants au Conseil national des sciences de Taïwan (NSC 101-2113-M-194-002) et à l’hôpital de la ville de Taipei de Taiwan pour le financement de la recherche.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

 

References

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 Sources :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20943052

Test traitements antibiotiques sur l’infection chronique à Chlamydia pneumoniae

Télithromycine Traitement de l’infection chronique à Chlamydia pneumoniae chez la souris C57BL / 6J

Des infections chroniques à Chlamydia pneumoniae ont été associées à l’athérosclérose, mais il manque des connaissances claires sur la manière de traiter ces infections. Nous avons étudié l’effet d’un nouvel antibiotique cétolide, la télithromycine, sur l’infection pulmonaire chronique de C. pneumoniae. Des souris femelles C57BL / 6J soumises à un régime à 0,2% de cholestérol ont été inoculées par voie intranasale avec C. pneumoniae soit deux ou trois fois toutes les quatre semaines. La télithromycine a été administrée aux souris par voie sous-cutanée à 75 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 5 ou 10 jours, en commençant 3 jours après la dernière inoculation. Des échantillons ont été prélevés 4 et 12 semaines après la dernière inoculation. La présence d’ADN de C. pneumoniae dans le tissu pulmonaire a été démontrée par PCR et la détection de l’accumulation de lipides dans le sinus aortique par coloration Oil-Red-O. C. pneumoniae La positivité de l’ADN et les réactions inflammatoires dans le tissu pulmonaire des souris inoculées deux fois étaient significativement affectées par le traitement après les deux inoculations ou seulement après la deuxième inoculation à 12 semaines. L’accumulation de lipides intimes dans le sinus aortique était également légèrement mais significativement moins abondante chez les souris traitées après les deux inoculations que chez celles traitées seulement après la deuxième inoculation pendant 10 jours (moyennes géométriques, 823 et 4324 μm2, respectivement, P = 0,033 ). Aucune différence entre les témoins infectés non traités et le groupe inoculé trois fois et traité pendant 5 jours n’a été observée. Nous concluons que la télithromycine est efficace pour prévenir le développement d’une infection chronique à C. pneumoniae et l’accumulation de lipides intimaux chez les souris C56BL / 6J lorsque le traitement est administré après chaque inoculation.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie intracellulaire obligatoire qui provoque des infections des voies respiratoires supérieures et inférieures. Semblable aux autres espèces de Chlamydia, il a tendance à provoquer des infections persistantes. Une infection persistante à C. pneumoniae a été associée à plusieurs maladies chroniques, telles que l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique  et la maladie coronarienne (CHD) , dans plusieurs études. C. pneumoniae est sensible aux macrolides et aux tétracyclines, qui sont couramment utilisés pour le traitement des infections aiguës à Chlamydia. Les fluoroquinolones, la rifampicine et, plus récemment, les cétolides se sont également révélés efficaces. À l’heure actuelle, la connaissance des thérapies réussies pour le traitement des infections latentes et persistantes est limitée. La définition et le développement de traitements appropriés efficaces et de moyens d’éradication de l’infection chronique par C. pneumoniae seraient cependant très importants, surtout si ces traitements s’avéraient avoir un effet sur le développement des maladies chroniques associées.

Des modèles animaux antérieurs ont montré que des inoculations répétées de Chlamydia augmentaient la présence et la persistance de l’ADN de Chlamydia dans plusieurs tissus de souris . Chlamydia. pneumoniae provoque également des modifications athéroscléreuses chez les lapins et les souris hyperlipidémiques, bien que des résultats controversés aient été publiés à partir d’études avec des modèles murins. En outre, il a été démontré qu’un traitement précoce des lapins infectés par C. pneumoniae avec des antibiotiques macrolides empêche le développement de l’athérosclérose, tandis que chez les souris déficientes en apolipoprotéine E, l’azithromycine ne diminue pas la progression des lésions lipidiques . Les deux premiers essais de traitement antibiotique à petite échelle avec des patients atteints de coronaropathie ont donné des résultats prometteurs concernant la diminution de l’incidence des événements cardiovasculaires. Dans une étude plus récente, des patients présentant un angor instable aigu ou un infarctus du myocarde sans onde Q ont été traités avec de la clarithromycine pendant 3 mois, ce qui a entraîné une réduction significative des événements cardiovasculaires pendant 555 jours en moyenne. Dans l’étude Azithromycine dans l’artériopathie coronaire: élimination du myocarde avec chlamydia (ACADEMIC), 3 mois de traitement par l’azithromycine chez des patients coronariens stables ont amélioré les marqueurs inflammatoires mais n’ont pas diminué les taux d’anticorps contre C. pneumoniae à 6 mois et n’a pas réduit les événements ischémiques au cours de la période de surveillance de deux ans. Très récemment, deux essais de traitement à l’azithromycine à grande échelle ont montré des résultats négatifs pour l’ensemble de la population: l’essai WIZARD comprenait 7 747 patients ayant déjà eu un infarctus du myocarde et des taux élevés d’anticorps contre C. pneumoniae et l’azithromycine chez les patients. L’étude du syndrome coronarien aigu (AZACS) a inclus 1 439 patients souffrant d’angor instable ou d’infarctus du myocarde (11). Les vastes essais en cours sur les antibiotiques et les patients atteints de coronaropathie peuvent fournir de nouvelles informations sur les effets préventifs possibles des antibiotiques sur les événements cardiovasculaires. D’autre part, d’autres modèles animaux sont nécessaires pour déterminer si les médicaments antimicrobiens peuvent éradiquer l’infection chronique à C. pneumoniae, établir l’effet du traitement antibiotique sur l’athérosclérose et déterminer le médicament optimal ou la combinaison de médicaments ainsi que le dosage et le moment de traitement.

Dans des études antérieures sur des souris, des inoculations multiples de C. pneumoniae ont provoqué seulement des réactions inflammatoires et aucun changement athérosclérotique dans les aortes ou les sinus aortiques de souris C57BL / 6J nourries de nourriture normale. Il a été démontré que les souris de cette souche sont sensibles à l’accumulation de lipides dans l’intima lorsqu’elles sont nourries avec un régime riche en graisses et en cholestérol, et avec ce type de régime, les inoculations de C. pneumoniae augmentent les risques d’athérosclérose. Dans la présente étude, nous avons étudié le développement de l’infection chronique et des réactions inflammatoires chez les souris sans les effets confusionnels possibles d’un régime riche en graisses et des modifications génétiques. Par conséquent, nous avons utilisé des souris C57BL / 6J normales nourries à 0,2% de cholestérol pour étudier les effets d’un antibiotique cétolide, la télithromycine, sur le traitement et l’éradication des infections chroniques à C. pneumoniae et sur le développement de lésions lipidiques dans les sinus aortiques. souris.

Organisme et inoculum.

L’isolat de C. pneumoniae Kajaani 7 (K7), une souche épidémique finlandaise (15) cultivée dans des cellules HL, a été utilisé dans l’étude. Les cellules infectées ont été récoltées avec des billes de verre stériles et perturbées par ultrasonication. Les débris cellulaires ont été séparés par centrifugation à basse vitesse, suivie d’une sonication et de deux cycles de centrifugation à grande vitesse, pour purifier les particules de Chlamydia. Finalement, le culot obtenu a été remis en suspension dans du tampon saccharose-phosphate-acide glutamique pour le stockage. Le nombre d’unités de formation d’inclusion (IFU) d’organismes viables par millilitre a été déterminé par culture dans des cellules HL. Brièvement, les cellules HL ont été infectées avec des dilutions de 10 fois de la culture mère de Chlamydia par centrifugation et incubées à 35 ° C dans 5% de C02 pendant 72 h. Le milieu de culture (RPMI 1640) contenait 7% de sérum fœtal bovin, 1% de l-glutamate, 20 ug de streptomycine par ml et 0,5 ug de cycloheximide par ml. La dose d’inoculum a été estimée sur cette base et la dose infectieuse administrée aux animaux a été confirmée par culture dans des cellules HL, comme décrit ci-dessus.

Modèle animal et traitement.

Des souris C57BL / 6J consanguines femelles de six semaines ont été achetées auprès de M & B A / S, Ry, Danemark. Une alimentation normale (1324, Altromin, Lage, Danemark) avec un supplément de 0,2% de cholestérol a été commencée lorsque les animaux sont arrivés dans les installations. Après 2 semaines d’un régime supplémenté en cholestérol, chaque souris a été inoculée par voie intranasale avec 1,05 x 106 IFU de C. pneumoniae K7 tandis que la souris était sous anesthésie au méthoxyflurane inhalé (Metofane, Schering-Plough, Bloomfield, N.J.). Une ou deux réinfections ont été administrées de la même manière 4 semaines (dose, 1,77 × 106 IFU / souris) et 8 semaines (dose, 2,2 × 106 IFU / souris) après l’inoculation primaire.

La télithromycine a été administrée aux souris par voie sous-cutanée à 75 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 5 ou 10 jours, en commençant le troisième jour après l’inoculation intranasale. La télithromycine a été dissoute avec de l’acide acétique glacial et ensuite diluée avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (concentration finale d’acide acétique, 0,1%). La dose de télithromycine utilisée a été choisie sur la base d’études préliminaires (52), dans lesquelles des doses de 25, 50 et 100 mg / kg pour le traitement de l’infection pulmonaire aiguë à C. pneumoniae ont été testées. Des doses de télithromycine de 50 et 100 mg / kg ont également été utilisées chez d’autres modèles murins (43, 51), et des doses aussi élevées sont apparemment nécessaires chez les souris ayant des taux métaboliques et d’élimination élevés pour obtenir de bonnes réponses thérapeutiques. Auparavant, Bonnefoy et al. (8) a été capable de mesurer les niveaux de télithromycine pendant 8 h après l’administration intraveineuse ou orale de 10 mg de médicament par kg à des souris suisses, et la demi-vie était de 1,2 h par voie intraveineuse.

Les souris ont été divisées en trois groupes de traitement et deux groupes de contrôle de placebo, avec 20 souris dans chaque groupe. Les groupes 1 et 2 ont été inoculés deux fois avec la chlamydia. Le groupe 1 a été traité pendant 10 jours après les deux inoculations, et le groupe 2 a été traité pendant 10 jours après la dernière inoculation, c’est-à-dire après l’infection (p.i.). Le groupe placebo (groupe 3) a reçu du diluant après les deux inoculations. Le groupe 4 a été inoculé trois fois et n’a été traité qu’après la dernière inoculation pendant 5 jours (bien que l’intention ait été de les traiter pendant 10 jours). L’autre groupe placebo (groupe 5) a été inoculé trois fois et a reçu un diluant après la dernière inoculation pendant 5 jours, similaire au groupe 4. Des échantillons ont été prélevés à 4 et 12 semaines p.i. Les schémas d’inoculation et de traitement sont également présentés sur la Fig. Le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut national de santé publique, Helsinki, Finlande, a approuvé toutes les procédures impliquant des animaux.

Mesure des titres d’anticorps contre C. pneumoniae.

Les titres d’anticorps ont été mesurés par le test de micro-immunofluorescence (décrit à l’origine ailleurs [55]) en utilisant des corps élémentaires entiers purifiés fixés au formol de K7 comme antigène. Les anticorps anti-immunoglobulines G (IgG) ont été détectés dans le sérum en utilisant des fragments [F (ab ‘) 2 d’IgG anti-souris conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine; Serotec].

Culture du tissu pulmonaire.

Les lobes du poumon droit ont été homogénéisés mécaniquement dans 2 ml de tampon saccharose-phosphate-acide glutamique. Les suspensions tissulaires ont été centrifugées pour éliminer les débris, et le surnageant a été recueilli et congelé à -70 ° C. Les débris de tissu pulmonaire restants ont été stockés pour la détection de l’ADN de C. pneumoniae. Les poumons des souris ont été dosés à 4 semaines p.i. pour la présence d’organismes viables de C. pneumoniae. Toutes les analyses ont été effectuées en double exemplaire. Des cellules HL infectées avec différentes dilutions des homogénats ont été centrifugées à 490 xg pendant 1 h et incubées à 35 ° C sous 5% de C02 pendant 72 h, après quoi les plaques ont été centrifugées de nouveau comme décrit ci-dessus, de nouveaux milieux de culture ont été ajoutés et les cultures ont été cultivées pendant 72 heures supplémentaires. Finalement, les cellules ont été lavées avec une solution de PBS, fixées avec du methanol et colorées avec un anticorps monoclonal spécifique du genre Chlamydia conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (Pathfinder, Sanofi Diagnostics Pasteur, Redmond, Wash.).

Détection de l’ADN de C. pneumoniae dans les tissus pulmonaires.

Des débris de tissu pulmonaire (50 mg) ont été lysés avec de la protéinase K (Qiagen) dans du tampon de lyse tissulaire (Qiagen). Après incubation à 56 ° C pendant une nuit, l’ADN a été purifié avec un kit de tissu QIAamp disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant (Qiagen). L’ADN purifié a été maintenu congelé à -20 ° C. Les amorces de PCR ont été synthétisées à l’Institute of Biotechnology, Helsinki, Finlande. Les séquences pour les amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN (produit de 135 pb), l’amorce HB1 (5’-ATAGTCTCCGTAAAATCCAGCACG-3 ‘) et l’amorce biotinylée HB2 (5′-CCTGTAGGGAACCCTTCTGATC-3′) proviennent du gène C. pneumoniae omp1 . La PCR a été réalisée avec un mélange de 400 μM de désoxynucléoside triphosphate, 4,0 mM de MgCl2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 100 mM de NaCl, 0,1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol, 50% de glycérol, 1% de Triton X-100, 1,0 U de Taq polymérase (PromegaTag), 50 pmol de chaque amorce, et 10 ul d’ADN isolé à partir d’échantillons cliniques. Le volume réactionnel total était de 50 ul. Après 5 min de dénaturation à 94 ° C, les échantillons ont été soumis à 50 cycles de dénaturation (94 ° C, 30 s), hybridation (55 ° C, 30 s) et extension (72 ° C, 30 s) avec un Thermocycleur Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600. Un essai d’hybridation par fluorescence à résolution temporelle avec une sonde d’hybridation marquée à l’Eu (5’-CCATATTGTACCATCAATTAA-3 ‘) (2 ng / 100 μl) a été utilisé pour tester la présence du produit de PCR spécifique de C. pneumoniae. La sonde a été incubée pendant une nuit à 37 ° C et la réaction a été arrêtée en lavant le mélange réactionnel 10 fois. Sinon, le test a été effectué comme décrit précédemment (44). La limite de détection du test de PCR est de 0,8 équivalent-génome. Tous les échantillons positifs dans la première série ont été testés deux fois, et le résultat a été considéré comme positif seulement si le résultat était le même dans les deux séries.

Détection de l’ADN de C. pneumoniae dans les tissus pulmonaires.

Des débris de tissu pulmonaire (50 mg) ont été lysés avec de la protéinase K (Qiagen) dans du tampon de lyse tissulaire (Qiagen). Après incubation à 56 ° C pendant une nuit, l’ADN a été purifié avec un kit de tissu QIAamp disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant (Qiagen). L’ADN purifié a été maintenu congelé à -20 ° C. Les amorces de PCR ont été synthétisées à l’Institute of Biotechnology, Helsinki, Finlande. Les séquences pour les amorces utilisées pour l’amplification de l’ADN (produit de 135 pb), l’amorce HB1 (5’-ATAGTCTCCGTAAAATCCAGCACG-3 ‘) et l’amorce biotinylée HB2 (5′-CCTGTAGGGAACCCTTCTGATC-3′) proviennent du gène C. pneumoniae omp1 . La PCR a été réalisée avec un mélange de 400 μM de désoxynucléoside triphosphate, 4,0 mM de MgCl2, 50 mM de Tris-HCl (pH 8), 100 mM de NaCl, 0,1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol, 50% de glycérol, 1% de Triton X-100, 1,0 U de Taq polymérase (PromegaTag), 50 pmol de chaque amorce, et 10 ul d’ADN isolé à partir d’échantillons cliniques. Le volume réactionnel total était de 50 ul. Après 5 min de dénaturation à 94 ° C, les échantillons ont été soumis à 50 cycles de dénaturation (94 ° C, 30 s), hybridation (55 ° C, 30 s) et extension (72 ° C, 30 s) avec un Thermocycleur Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600. Un essai d’hybridation par fluorescence à résolution temporelle avec une sonde d’hybridation marquée à l’Eu (5’-CCATATTGTACCATCAATTAA-3 ‘) (2 ng / 100 μl) a été utilisé pour tester la présence du produit de PCR spécifique de C. pneumoniae. La sonde a été incubée pendant une nuit à 37 ° C et la réaction a été arrêtée en lavant le mélange réactionnel 10 fois. Sinon, le test a été effectué comme décrit précédemment (44). La limite de détection du test de PCR est de 0,8 équivalent-génome. Tous les échantillons positifs dans la première série ont été testés deux fois, et le résultat a été considéré comme positif seulement si le résultat était le même dans les deux séries.

Statistiques.

Le test non paramétrique de Mann-Whitney U a été utilisé pour des analyses statistiques des zones d’accumulation de lipides. La positivité PCR a été testée par le test du chi carré de Pearson ou le test exact de Fisher, selon le cas, et les résultats de l’histopathologie pulmonaire ont été testés par le test du chi carré pour la tendance (SPSS pour Windows, version 10.0.5). Les valeurs exactes de P ont été rapportées comme appropriées.

RÉSULTATS

Observations cliniques.

Aucun symptôme d’infection respiratoire n’a été détecté chez les souris inoculées avec la chlamydia, et les souris dans tous les groupes ont pris du poids régulièrement tout au long de l’étude. Pour une raison inconnue, les souris inoculées trois fois et traitées seulement après la dernière inoculation ont eu une irritation cutanée et ont développé des plaies aux sites d’injection sur leur cou. L’irritation et les lésions cutanées ont été détectées principalement dans les groupes traités par télithromycine, mais elles ont également été détectées dans une certaine mesure dans les groupes placebo. Pour cette raison, le traitement de ces groupes a dû être terminé après 5 jours, après quoi les plaies cicatrisent rapidement. Par conséquent, le temps de traitement pour ces souris (groupe 4) après la dernière inoculation était de seulement 5 jours, alors qu’il était de 10 jours dans les groupes de souris (groupes 1 et 2) inoculés deux fois.

Sérologie

Toutes les souris avaient des titres d’anticorps> 128, mesurés par la méthode de micro-immunofluorescence. A 4 semaines pi, les souris inoculées deux fois et traitées après les deux inoculations avaient des titres d’anticorps significativement plus élevés (moyenne géométrique des titres par groupe d’étude, 987) que le groupe placebo (titre moyen 530) (P = 0,025, test U de Mann-Whitney) ). A 12 semaines p.i., les titres correspondants dans ces deux groupes étaient de 630 et 461, mais la différence n’était plus statistiquement significative.

Culture de C. pneumoniae et détection de l’ADN du tissu pulmonaire.

Tous les homogénats de tissu pulmonaire des échantillons prélevés à 4 semaines p.i. étaient culture négative. La méthode d’hybridation que nous avons utilisée avec la PCR a donné une valeur quantitative pour la quantité d’ADN amplifié dans le produit de PCR, mais pas directement pour la quantité d’ADN d’origine dans l’échantillon. Pour cette raison, nous avons comparé les groupes uniquement sur la base de résultats positifs et négatifs. Les valeurs positives se réfèrent donc au nombre de souris ADN-positives par groupe, exprimé en pourcentage. Les valeurs de positivité de l’ADN de C. pneumoniae à 4 et 12 semaines p.i. pour les souris recevant différents traitements sont représentés sur la Fig. Fig.2.2. Chez les souris inoculées deux fois, les taux de positivité de l’ADN diminuent significativement de 4 à 12 semaines p.i. dans les deux groupes de traitement, alors que la diminution dans le groupe traité par placebo n’était pas significative. Le traitement administré après les deux inoculations était le plus efficace, avec seulement 10% (2 sur 20) des souris restant positives pour la PCR. Chez les souris inoculées trois fois, le traitement après la dernière inoculation n’a pas significativement diminué le taux de positivité de l’ADN, et dans le groupe témoin traité par placebo, le taux de positivité a même augmenté légèrement entre 4 et 12 semaines p.i. (42 et 59%, respectivement). Le nombre d’échantillons avec des résultats discordants (échantillons positifs au premier tour d’analyse et négatifs au second tour) était de 6 sur 60 (10%) échantillons (à l’exclusion des échantillons avec des résultats négatifs) à 4 semaines p.i. et, de même, 19 échantillons sur 54 (35%) à 12 semaines p.i.

Histopathologie pulmonaire.

Aucun changement inflammatoire marqué ou sévère (grades 3 et 4, respectivement), qui sont fréquemment présents au cours de l’infection aiguë C. pneumoniae chez les souris, ont été détectés dans cette étude. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes à 4 semaines p.i. (résultats non montrés), mais à 12 semaines pi, un traitement précoce par la télithromycine a nettement diminué le niveau d’inflammation dans les poumons des souris: une réaction inflammatoire modérée (grade 2) était présente chez 50% des souris non traitées, 11% des ceux traités seulement après la dernière inoculation, et 5% des souris traitées après les deux inoculations (P = 0,009, test du chi carré pour la tendance) (Tableau (Tableau 1) .1). Les traitements administrés après les trois inoculations n’ont eu aucun effet sur les réactions inflammatoires dans les poumons. Lorsque les scores d’histopathologie pulmonaire ont été comparés aux taux de positivité PCR pour les souris traitées à la télithromycine, plus de souris positives à l’ADN ont été observées chez les souris avec histologie 1 et 2 aux deux moments, et les tendances étaient statistiquement significatives (P = 0,017 à 4 semaines pi et P = 0,031 à 12 semaines pi, test du chi carré pour la tendance) (Fig. (Fig.3B) .3B). Pour les souris témoins traitées par placebo, une tendance significative a été observée seulement à 4 semaines p.i. (P = 0,043, test du chi-carré pour la tendance) (Fig. (Fig.3A3A).

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DISCUSSION

Dans cette étude, nous avons montré que le traitement par télithromycine supprime la réaction inflammatoire pulmonaire, réduit le nombre de souris positives pour l’ADN de C. pneumoniae (poumons) et affecte l’accumulation de lipides dans le sinus aortique chez les souris C57BL / 6J avec des infections chlamydiennes chroniques. est donné après chaque inoculation. Le traitement après les deux inoculations diminue significativement le taux d’ADN de C. pneumoniae chez la souris à 12 semaines pi, mais l’ADN reste détectable dans le tissu pulmonaire, malgré le traitement: à 3 mois pi, les tissus pulmonaires de 10% des souris inoculées et traitées deux fois , 28% de ceux inoculés deux fois et traités une fois après la dernière inoculation, et 60% de ceux inoculés trois fois et traités seulement après la dernière inoculation étaient PCR positifs. Les proportions de résultats discordants détectés par analyse PCR étaient de 10% à 4 semaines p.i. et 35% à 12 semaines p.i. Le pourcentage élevé d’incohérence à 12 semaines peut être en partie dû à la très faible quantité d’ADN chlamydial présent, ce qui entraîne des problèmes de sensibilité. Répétitions de toutes les analyses plus d’une fois aurait probablement donné des résultats encore plus précis.

En accord avec nos résultats, il a été démontré dans une étude précédente (5) que l’ADN chlamydial persiste pendant 2 mois dans 38% des tissus pulmonaires de souris NMRI inoculées une fois et traitées pendant 7 jours avec une combinaison d’azithromycine et de rifampine tôt après la infection. Dans une autre étude, l’ADN chlamydial est resté détectable pendant 26 semaines chez la moitié des souris déficientes en ApoE inoculées deux fois et a reçu un traitement retardé avec deux doses d’azithromycine (47). Une étude récente chez l’homme a montré que la persistance de l’ADN de C. pneumoniae dans les écouvillons nasopharyngés était corrélée à la persistance des symptômes (35). Certains patients peuvent présenter des infections persistantes et des symptômes prolongés ou des rechutes avec des résultats positifs de culture et / ou de PCR et peuvent ne pas être guéris par un traitement conventionnel pendant 7 à 21 jours (16, 26, 35, 46); même un traitement prolongé a été inefficace dans certains cas (16).

Les souris C57BL / 6J utilisées dans l’étude se sont révélées sensibles à l’infection chlamydienne, ce qui entraîne une pneumonie auto-restreinte (54, 57). Après inoculation secondaire, la plupart des chlamydiae sont éradiquées en 3 à 4 semaines chez ces souris (54), mais comme indiqué ci-dessus, la persistance de l’ADN bactérien est détectée chez certains animaux. Conformément à cela, nous n’avons trouvé aucune chlamydia viable dans le tissu pulmonaire par culture à 4 semaines p.i., et une infection réussie a été confirmée par des titres élevés d’anticorps IgG de C. pneumoniae. On s’est demandé si la présence d’ADN de Chlamydia pouvait être considérée comme un indicateur d’une infection chronique persistante. Antérieurement, l’infection persistante par C. pneumoniae, culture négative, chez la souris, démontrée en tant que PCR positive du tissu pulmonaire après l’inoculation primaire, s’est révélée être réactivée par un traitement immunosuppresseur à la cortisone (32, 33). Dans la présente étude, des souris non traitées inoculées trois fois ont montré une légère augmentation de la positivité PCR pendant 8 semaines de surveillance (entre 4 et 12 semaines p.i.), et seulement une diminution marginale a été observée dans un groupe traité par télithromycine. La persistance de la positivité PCR a été observée moins souvent chez les souris n’ayant reçu que deux inoculations. Ceci est en accord avec les résultats d’études antérieures (36), qui ont montré que la persistance de l’ADN augmente avec des inoculations répétées. L’histopathologie pulmonaire a détecté une réaction inflammatoire modérée (grade 2) chez 50 et 42% des souris dans les groupes inoculés avec C. pneumoniae deux et trois fois, respectivement, et traitées avec un placebo à 12 semaines p.i. Dans nos études préliminaires, l’inflammation de grade 2 n’a pas été observée chez des souris C57BL / 6J inoculées simulées du même âge (L. Törmäkangas, M. Leinonen et P. Saikku, données non publiées). De plus, dans les groupes traités par la télithromycine et les groupes non traités, la positivité de la PCR était nettement plus fréquente chez les souris présentant une inflammation des poumons de grade 1 et 2 que chez celles n’ayant pas d’inflammation. Ces résultats suggèrent la présence continue d’une forme chronique et non cultivable de chlamydia qui maintient l’inflammation dans le tissu pulmonaire. Des études in vitro ont montré que C. pneumoniae est capable de persister dans un état métaboliquement actif et viable dans les monocytes et macrophages humains avec un développement restreint de descendance infectieuse (2) et d’induire une infection persistante non réplicative mais viable lorsqu’elle est exposée à l’interféron gamma stimulation (4). In vivo, des macrophages alvéolaires et péritonéaux provenant de souris inoculées se sont révélés capables de transmettre l’infection à des souris non infectées (37) et C. pneumoniae est fréquemment trouvé dans les cellules mononucléaires circulantes dans des échantillons de sang périphérique humain (50). De plus, Gieffers et al. (20) et Yamaguchi et al. (56) ont récemment montré que des isolats de C. pneumoniae inoculés dans des monocytes humains circulants (20) et des lymphocytes primaires de souris (56) sont résistants à un traitement antibiotique.

Le moment du traitement semble avoir une influence sur le développement de l’infection chronique et des lésions athérosclérotiques. Dans une étude précédente, Rothstein et al. (47) ont traité des souris déficientes en ApoE qui avaient été inoculées deux fois avec une dose orale d’azithromycine à 2 et 3 semaines p.i. A l’âge de 26 semaines, c’est-à-dire 12 semaines p.i., l’infection par C. pneumoniae a augmenté la taille des lésions colorées à l’huile rouge-rouge aortique chez les souris infectées, mais l’azithromycine n’a pas réduit leur taille (47). Le retard dans le début du traitement vu dans l’étude de Rothstein et al. (47) peut avoir causé le résultat négatif. Cet effet a également été démontré dans des modèles de lapin par Muhlestein et al. (39) et Fong et al., Qui ont inoculé les lapins trois fois et les ont traités avec de l’azithromycine (17) ou de la clarithromycine (17, 19). Dans les deux dernières études (17, 19), le traitement tardif à la clarithromycine a légèrement diminué la zone de développement des lésions athéroscléreuses, alors que tous les traitements précoces dans les trois études étaient significativement efficaces pour diminuer les zones lésées.

Les souris C57BL / 6J utilisées dans l’étude se sont révélées sensibles à l’infection chlamydienne, ce qui entraîne une pneumonie auto-restreinte (54, 57). Après inoculation secondaire, la plupart des chlamydiae sont éradiquées en 3 à 4 semaines chez ces souris (54), mais comme indiqué ci-dessus, la persistance de l’ADN bactérien est détectée chez certains animaux. Conformément à cela, nous n’avons trouvé aucune chlamydia viable dans le tissu pulmonaire par culture à 4 semaines p.i., et une infection réussie a été confirmée par des titres élevés d’anticorps IgG de C. pneumoniae. On s’est demandé si la présence d’ADN de Chlamydia pouvait être considérée comme un indicateur d’une infection chronique persistante. Antérieurement, l’infection persistante par C. pneumoniae, culture négative, chez la souris, démontrée en tant que PCR positive du tissu pulmonaire après l’inoculation primaire, s’est révélée être réactivée par un traitement immunosuppresseur à la cortisone (32, 33). Dans la présente étude, des souris non traitées inoculées trois fois ont montré une légère augmentation de la positivité PCR pendant 8 semaines de surveillance (entre 4 et 12 semaines p.i.), et seulement une diminution marginale a été observée dans un groupe traité par télithromycine. La persistance de la positivité PCR a été observée moins souvent chez les souris n’ayant reçu que deux inoculations. Ceci est en accord avec les résultats d’études antérieures (36), qui ont montré que la persistance de l’ADN augmente avec des inoculations répétées. L’histopathologie pulmonaire a détecté une réaction inflammatoire modérée (grade 2) chez 50 et 42% des souris dans les groupes inoculés avec C. pneumoniae deux et trois fois, respectivement, et traitées avec un placebo à 12 semaines p.i. Dans nos études préliminaires, l’inflammation de grade 2 n’a pas été observée chez des souris C57BL / 6J inoculées simulées du même âge (L. Törmäkangas, M. Leinonen et P. Saikku, données non publiées). De plus, dans les groupes traités par la télithromycine et les groupes non traités, la positivité de la PCR était nettement plus fréquente chez les souris présentant une inflammation des poumons de grade 1 et 2 que chez celles n’ayant pas d’inflammation. Ces résultats suggèrent la présence continue d’une forme chronique et non cultivable de chlamydia qui maintient l’inflammation dans le tissu pulmonaire. Des études in vitro ont montré que C. pneumoniae est capable de persister dans un état métaboliquement actif et viable dans les monocytes et macrophages humains avec un développement restreint de descendance infectieuse (2) et d’induire une infection persistante non réplicative mais viable lorsqu’elle est exposée à l’interféron gamma stimulation (4). In vivo, des macrophages alvéolaires et péritonéaux provenant de souris inoculées se sont révélés capables de transmettre l’infection à des souris non infectées (37) et C. pneumoniae est fréquemment trouvé dans les cellules mononucléaires circulantes dans des échantillons de sang périphérique humain (50). De plus, Gieffers et al. (20) et Yamaguchi et al. (56) ont récemment montré que des isolats de C. pneumoniae inoculés dans des monocytes humains circulants (20) et des lymphocytes primaires de souris (56) sont résistants à un traitement antibiotique.

Le moment du traitement semble avoir une influence sur le développement de l’infection chronique et des lésions athérosclérotiques. Dans une étude précédente, Rothstein et al. (47) ont traité des souris déficientes en ApoE qui avaient été inoculées deux fois avec une dose orale d’azithromycine à 2 et 3 semaines p.i. A l’âge de 26 semaines, c’est-à-dire 12 semaines p.i., l’infection par C. pneumoniae a augmenté la taille des lésions colorées à l’huile rouge-rouge aortique chez les souris infectées, mais l’azithromycine n’a pas réduit leur taille (47). Le retard dans le début du traitement vu dans l’étude de Rothstein et al. (47) peut avoir causé le résultat négatif. Cet effet a également été démontré dans des modèles de lapin par Muhlestein et al. (39) et Fong et al., Qui ont inoculé les lapins trois fois et les ont traités avec de l’azithromycine (17) ou de la clarithromycine (17, 19). Dans les deux dernières études (17, 19), le traitement tardif à la clarithromycine a légèrement diminué la zone de développement des lésions athéroscléreuses, alors que tous les traitements précoces dans les trois études étaient significativement efficaces pour diminuer les zones lésées.

A notre connaissance, le modèle murin décrit ici est le premier à démontrer que le traitement antimicrobien affecte la formation de lésions lipidiques du sinus aortique chez des souris infectées par C. pneumoniae. Les résultats doivent être interprétés avec prudence en raison du large éventail de zones de lésions dans chaque groupe. Malgré la variabilité, l’effet du traitement était statistiquement significatif lorsque la télithromycine était administrée après chaque inoculation par rapport à l’effet obtenu lorsque les souris étaient traitées seulement après la deuxième inoculation dans les groupes inoculés deux fois. Cependant, aucune différence statistique n’a été observée lorsque les résultats du groupe traité deux fois ont été comparés à ceux du groupe témoin traité par placebo. Il est regrettable que le traitement des souris inoculées trois fois doive être interrompu après 5 jours en raison d’une irritation de la peau et que les effets d’un traitement de 10 jours sur l’accumulation de lipides ne puissent pas être évalués pour ce groupe. Les inconvénients de notre étude sont que nous n’étions pas en mesure d’évaluer les sinus aortique, où les lésions ont été détectées, la présence de l’antigène chlamydia, ni  nous n’avons un groupe témoin non infecté permettant de comparer les résultats pour les inoculées, les animaux non traités . Nous ne pouvons donc pas estimer l’influence directe des chlamydiaes sur le développement des lésions athéroscléreuses. Les inoculations répétées ont clairement augmenté la persistance du pathogène dans le tissu pulmonaire, et le traitement a diminué ce développement dans le groupe traité deux fois, mais des études supplémentaires avec plus de souris sont nécessaires pour vérifier les résultats d’accumulation de lipides et déterminer si les niveaux diminuent. Le modèle de souris était vraiment dû à l’effet antichlamydial de la télithromycine.

Les antibiotiques macrolides, en particulier les dérivés semi-synthétiques de l’érythromycine A (comme la clarithromycine et la roxithromycine), possèdent plusieurs propriétés anti-inflammatoires (28, 30, 48). Structurellement, la télithromycine est dérivée de l’érythromycine A (14), mais il n’y a pas de rapports sur les effets anti-inflammatoires potentiels de la télithromycine. Dans notre étude, certaines souris se sont révélées positives à la PCR même lorsqu’aucune inflammation n’a été détectée dans le tissu pulmonaire des groupes traités par télithromycine, alors qu’aucun ADN chlamydial n’a été détecté dans le tissu pulmonaire des souris non traitées sans inflammation. Cela peut être dû à un effet anti-inflammatoire de la télithromycine. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l’accumulation réduite de lipides dans les groupes de traitement soit également due à l’effet anti-inflammatoire, bien que le traitement ait intensifié la réponse de l’anticorps IgG à C. pneumoniae. Fong et al. (19) ont suggéré que l’action anti-inflammatoire de la clarithromycine n’était pas très marquée chez les lapins, car chez les lapins nourris au cholestérol non infectés, la diminution du développement des lésions athéroscléreuses observées après le traitement à la clarithromycine était mineure comparée à celle observée chez les chlamydia-inoculés. lapins.

Le fait que seul un traitement administré tôt après l’infection semble efficace pour prévenir le développement d’une infection chronique et réduire l’athérosclérose accélérée par l’infection dans des modèles animaux devrait être pris en compte lors de futurs essais de traitement chez l’homme. Comme la plupart des agents antimicrobiens utilisés pour traiter les infections à Chlamydia affectent seulement les bactéries qui se répliquent, leur potentiel à guérir les infections chroniques peut être modeste.

En conclusion, nos données suggèrent que la télithromycine a le potentiel d’affecter le développement de l’infection chronique à C. pneumoniae dans un modèle de souris et que le traitement par télithromycine peut avoir un effet sur la diminution des changements athérosclérotiques chez ces souris. Ces effets ont été observés uniquement dans les groupes dans lesquels le traitement a été administré après chaque inoculation, mais certaines souris dans ces groupes sont restées positives à l’ADN. Sur la base des résultats actuels et des résultats obtenus avec d’autres modèles animaux, nous émettons l’hypothèse que les traitements antimicrobiens conventionnels ne sont pas efficaces pour éradiquer totalement les chlamydia chroniques et persistantes et que les effets des schémas thérapeutiques plus longs et / ou des combinaisons d’antibiotiques différents être étudié plus avant.

Source et références

Cette étude a été financée par Aventis Pharma, Paris, France.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC521883/

Effet de l’azithromycine plus la rifampicine par rapport à l’amoxicilline seule sur l’éradication et l’inflammation dans l’évolution chronique de la pneumonie à Chlamydia pneumoniae chez la souris.

Les effets du traitement par l’azithromycine et la rifampicine (A + R), l’amoxicilline (A) ou le placebo (P) sur l’évolution chronique de la pneumonie expérimentale à Chlamydia pneumoniae chez la souris ont été évalués par culture, PCR et immunocytochimie. inflammation dans le tissu pulmonaire. L’éradication de l’agent pathogène était significativement plus fréquente et l’inflammation dans les tissus était significativement réduite après traitement par A + R comparé à après traitement par A ou P. Le traitement combiné avec azithromycine et rifampicine a montré des effets favorables dans l’évolution chronique de la pneumonie C. pneumoniae.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10817751

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10348778

Effets de deux régimes antibiotiques sur le cours et la persistance expérimentale de la pneumonie TWAR Chlamydia pneumoniae.

Nous avons étudié les effets de deux régimes antibiotiques sur l’évolution de l’infection à Chlamydia pneumoniae dans les poumons de souris Swiss Webster. Après une provocation intranasale avec des isolats AR-388 (1,3 x 10 (7) unités formant une inclusion par souris) et AR-39 (1,5 x 10 (6) unités formant une inclusion par souris), des groupes d’animaux ont été traités avec de la doxycycline ( 10 mg / kg de poids corporel une fois par jour pendant 3 jours), l’azithromycine (10 mg / kg [dose unique]) ou une solution saline. Les réponses ont été évaluées par l’isolement des organismes en culture cellulaire, la détection de l’ADN de TWAR dans les tissus pulmonaires par PCR et l’histologie pulmonaire. Les deux schémas thérapeutiques ont été efficaces pour éliminer les infections induites par l’AR-388 (p = 0,02 et 0,007 pour la doxycycline et l’azithromycine, respectivement) par rapport aux témoins. L’ADN de TWAR a été détecté dans 77 et 25% des poumons négatifs pour la culture deux semaines après le traitement des infections AR-388 et AR-39, respectivement. Les changements histologiques ont montré une pneumonie interstitielle et étaient similaires dans le temps pour tous les groupes. L’azithromycine à dose unique a produit des concentrations de médicament dans les tissus pulmonaires supérieurs aux CMI pour les souches étudiées pendant une période trois fois plus longue que celle de la doxycycline à dose unique. Nous avons conclu que les régimes antibiotiques à court terme ont été couronnés de succès dans le traitement de la pneumonie à TWAR expérimentale chez la souris. L’ADN de TWAR a été fréquemment récupéré des tissus pulmonaires après un traitement apparemment réussi.

Source

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7695327

 

Compléments d’informations sur les antibiotiques et les co infections « Chlamydias, Rickettsia, Bartonnella »

Démonstration intéressante sur la pénétration des antibiotiques en fonction du PH  précise l’utilité de la Rifampicine ou du plaquenil dans une thérapie par antibiotique ou en cas d’antibio résistance à la doxy ou aux macrolides.

http://www.infectiologie.com/UserFiles/File/formation/du/grenoble/dutai-grenoble-2016-17-anti-intracellulaires-cdentan.pdf

 

Chlamydia et Ostéoporose ?

L’infection à Chlamydia pneumoniae entraîne une perte osseuse généralisée chez la souris

L’ostéoporose est associée à une perte osseuse générale. On ne sait pas si les infections pourraient contribuer à l’ostéoporose. Chlamydia pneumoniae provoque des infections chroniques et produit potentiellement des cytokines résorptives osseuses. L’effet de l’infection par C. pneumoniae a été étudié in vivo chez des souris âgées de 10 semaines (c57BL / 6) et in vitro dans la lignée cellulaire humaine ressemblant aux ostéoblastes hFOB 1.19 (hFOB). La densité minérale osseuse (DMO) a été mesurée avant et 16 jours après l’infection. Les souris infectées par C. pneumoniae présentaient une DMO totale et sous-corticale (p <0,05) au niveau du fémur distal et du tibia proximal par rapport aux témoins, mais aucune différence de gain de poids corporel. Les taux d’IL-6 (56 contre 39 pg / mL, p = 0,02) et IL-1beta (11 contre 0 pg / mL, p = 0,003) dans les sérums et les lymphocytes T CD3 (+) étaient plus élevés (p = 0,04). chez les souris infectées par rapport aux contrôles. In vitro, le hFOB infecté par C. pneumoniae était associé à une augmentation de l’expression de l’ARNm de l’IL-6 (p = 0,01) et du RANKL (p <0,05); de plus, la sécrétion d’IL-6 augmentait de manière dose-dépendante (p <0,05). En résumé, les souris infectées par C. pneumoniae présentaient une perte osseuse généralisée associée à une augmentation de l’IL-6 et de l’IL-1. En outre, C. pneumoniae a établi une infection dans une lignée cellulaire d’ostéoblastes in vitro avec des profils de cytokines similaires à ceux in vivo, supportant une liaison causale.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19103778

 

 

 

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Induction de cytokines pro-inflammatoires dans des cellules ostéoblastiques humaines par Chlamydia pneumoniae.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie Gram négatif intracellulaire obligatoire qui provoque une pharyngite récurrente, une pneumonie et une inflammation chronique induite par des cycles de persistance et d’infection productive qui pourraient également expliquer l’association avec des maladies chroniques. Le but de cette étude était de déterminer si C. pneumoniae peut envahir et survivre dans les ostéoblastes humains et si cette infection provoque la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Nos résultats ont démontré que C. pneumoniae était capable d’infecter la lignée cellulaire ostéoblastique SaOS-2 et de se répliquer dans les ostéoblastes d’une manière dépendant du temps et a été associée à une augmentation du nombre de cellules et de la viabilité cellulaire. En outre, l’infection de la lignée cellulaire SaOS-2 avec C. pneumoniae à MOI de 4 est corrélée à une réponse pro-inflammatoire. Les ostéoblastes infectés ont produit des taux accrus de cytokines IL-6, IL-8, IL-17 et IL-23. La production de cytokines a augmenté avec l’interaction ultérieure entre les ostéoblastes et les monocytes et les niveaux maximum de cytokines libérées ont été détectés 72 h après l’infection par C. pneumoniae. Ainsi, le contrôle de la libération de chimiokines, par exemple, IL-23, peut être une stratégie thérapeutique pour prévenir une maladie osseuse inflammatoire et contrecarrer l’inflammation et la destruction osseuse.

 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21803599

Un colloque sur Lyme et ses co-infections a eu lieu au mois de Juin

Cela se passe en ligne aux USA, pour les personnes bilingues cela peut être intéressant d’écouter les conférences de différents spécialistes dont l’approche sera différente mais enrichissante.

The Chronic Lyme Disease Summit 2 , C’est gratuit du 19 au 26 juin 2017,

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Ce qui ressort lors de toutes les interventions

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  • Les plantes, type Artemésia, Cat’s Claw, Red Root pour la Lymphe
  • Plantes contre les biofilms. Serrapteptase…
  • L’importance que le patient « s’éduque »…. »nous sommes notre propre guérisseur »  et ne pas oublier que chaque cas est unique. Nous n’avons pas la même tolérance pour tout.
  • Déparasitage, hygiène de vie, bien dormir, bien mangé bio « hygiène +++ » pour aider le métabolisme », pour aider les fonctions mitochondrial , respiration, relaxation….

Cistus incanus, une plante fascinante pleine de ressources pour notre immunité

La composition polyphénolique du thé aux herbes de Cistus incanus et son activité antibactérienne et anti-adhérente contre Streptococcus mutans.

Antiviral, antifongique, bactéricide anti biofilm ? Elle est recommandée par le dr Klinghart.

Riche en polyphénols autant que le renoué du Japon

La plante méditerranéenne Cistus incanus est riche en polyphénols et a montré plusieurs activités pharmacologiques, principalement des effets antibactériens. En outre, des études in situ ont révélé qu’une infusion de C. incanus réduit l’adhérence bactérienne initiale dans la cavité buccale due aux polyphénols, ce qui indique que C. incanus pourrait réduire le risque de maladie de la carie. Dans la présente étude, les polyphénols de quatre différents tisanes commerciales de C. incanus ont été extraits par extraction standardisée des solvants accélérés pour des tests in vitro et par perfusion pour des tests in situ. Les deux extraits ont été caractérisés qualitativement et quantitativement par chromatographie liquide à haute performance et seule la teneur en polyphénols a varié légèrement. Au moyen de la détection de réseau de diodes et de la spectrométrie de masse, 29 polyphénols, y compris les ellagitannines, les flavanols et les flavonols glycosylés, ont été identifiés. De ce fait, seules des différences quantitatives mais non qualitatives entre les quatre échantillons ont été détectées. En outre, l’activité antibactérienne in vitro des extraits de solvant accélérés de C. incanus contre Streptococcus mutans, l’une des principales espèces bactériennes cariogènes, a été examinée à l’aide d’un test vivant / mort (BacLight®). Avec cette approche, C. incanus a donné des propriétés antibactériennes. Des expériences in situ supplémentaires indiquent que les rinçages avec une infusion de C. incanus ont réduit la colonisation bactérienne initiale des échantillons d’émail exposés aux fluides oraux pendant plus de huit heures. En outre, il a été démontré par microscopie électronique à transmission que l’application d’une infusion de C. incanus modifie l’ultrastructure de la pellicule d’émail acquise, ce qui donne une morphologie plus dense aux électrons. On peut supposer que les polyphénols sont responsables des effets observés

Activités antibactériennes et antifongiques des extraits de feuilles de Cistus incanus et C. monspeliensis.

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Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26291656

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10709448